Kantasolut ja Soluterapia Mika Pietilä Luentosarja TKK, 11-26.02.2010

Kantasolut lääketeollisuudessa

Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä EU:n direktiivi 86/609/EEC Koe-eläinten suojelulaki Kattaa kaikki eläinkokeet, jotka liittyvät seuraaviin prosesseihin Lääkkeen ja kemikaalin kehitys Fysiologiset tutkimukset Ympäristövaikutusten tutkiminen Uusien ruokalisien testaus Artikla 7 Edellyttää käyttämään muuta olemassa olevaa menetelmää eläinkokeen tilalla “. . .An experiment shall not be performed if another scientifically satisfactory method of obtaining the result sought, not entailing the use of an animal, is reasonably and practicably available (Art.7.2). . .”

Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä Direktiivi vaatii uusien korvaavien menetelmien kehitystä, validointia ja hyväksyttämistä 3R’s principle Reduce, refine or replace the use of laboratory animals OECD guidance document 34 Tiukat kriteerit vaihtoehtoisten in vitro toksisuustestien validoimiseen GLP (Good Laboratory Practise) GCCP (Good Cell Culture Practise) Kantasolujen kohdalla vaaditaan ylimääräisiä laatukriteereitä niiden ainutlaatuisen ominaisuuden takia Pluripotenssin ja erilaistumispotentiaalien osoittaminen

Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä REACH (Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals) Regulation (EC) No 1907/2006 Kannustaa myös uusien vaihtoehtoisten menetelmien kehittämistä uusien kemikaalien testaukseen (artikla 1) Annex XI In Vitro testien tulosten tulkitseminen Results from suitable in vitro methods Results from validated in vitro methods

Kantasolut lääketeollisuudessa: Lainsäädäntöä ”Cosmetic directive” (76/768/EEC) Eläinkokeiden poisto kosmeetiikkateollisuudessa Poikkeuksena toistetun annosmäärän toksiuus (Repeated-dose Toxicity), lisääntymiskykyisyyteen liittyvät toksisuus testit ja toksikokineettiset tutkimukset Kantasolut nähdään näihin hyvinä korvaajina Workshop 2008: New Perspectives on Safety of the European Partnership on Alternative Approaches (EPAA) Esiteltiin 11.3.2009 Dead line 11.3.2013

Kantasolut lääketeollisuudessa

Kantasolut lääketeollisuudessa Kantasolut soveltuvat hyvin testimateriaaliksi Herkkiä soluja Voimakas jakautumiskyky Mahdollista tuottaa erityyppisiä soluja/malleja toksisuustestaukseen In vitro solumallit vähentää lajien välisistä eroista johtuvia virheitä (vrt. Eläinkokeet) Mahdolliset kantasolutyypit Alkion kantasolut Aikuisen kantasolut (mesenkymaaliset) iPS

Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut Käyttöä tutkimuksessa rajoittaa eettiset ja lainsäädännölliset tekijät Tiukka tieteellinen ja eettinen arviointi ennen hyväksyntää EU rahoittaa 18 projektia, joista 4 keskittyy toksisuustestien kehittämiseen

Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut Vojnits and Breme. Toxicology 2010, DOI:10.1016/j.tox.2009.12.003

Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut Etuja: Jatkuva jakautumiskyky Solupankkien pystyttäminen Voidaan karakterisoida muutama linja  standardoitu testausmateriaali Pluripotentiaalinen erilaistumiskyky Erilaisia solutyyppejä (esim sydänlihassolut) Kehitettävää: Laatukontrollien kehittäminen Linjojen välillä eroja erilaistumiskyvyssä ja erilaistumattomuusasteessa Identiteetin määrittäminen, pitkäaikainen stabiilisuus, erilaistumiskyky (Loring and Rao. 2006. Stem Cells 24(1):145-150) Reference standards

Kantasolutyypit: Ihmisen alkion kantasolut Vojnits and Breme. Toxicology 2010, DOI:10.1016/j.tox.2009.12.003

Kantasolutyypit: Induced Pluripotent Stem cells Alkion kantasolun kaltaisia Ei eettisiä ongelmia Samat edut kuin alkion kantasoluissa Laatukontrollit Morfologialtaan alkion kantasolun kaltaisia, rajaton proliferaatiokyky Geeniekspressio alkion kantasolujen kaltainen Pluripotentiaalinen erilaistumiskyky Pintamarkkerit: SSEA-3 ja 4, TRA-1-60 TRA-1-81 Teratooman muodostus in vivo Pluripotentiaalisuuden säätelytekijät Oct4, Sox2, Nanog, C-Myc, Klf4, Lin28

Kantasolutyypit: Aikuisen kantasolut/primaarisolut Mesenkymaaliset kantasolut Luuydin, napaveri, rasvakudos Somaattiset primaarisolut Maksasolut, ihon fibroblastit Etuja: Ihmisen fysiologisia soluja  solujen oikeanlainen toiminta Heikkouksia: Vaikeita standardoida (potilaiden välillä suuria eroja solujen toiminnassa) Mahdollisia toiminnallisia muutoksia Menettäneet tärkeät toimintakyvyt Lääkeresistenssi?

Erilaisia sovellutuksia in vitro toksisuustestaukseen Alkion kantasoluista erilaistetut sydänlihassolut Ainutlaatuinen lähde Eristetyt sydänlihassolut huonoja kasvamaan in vitro Minimoidaan lajien väliset erot (eläinkoe) Sydän tärkeä elin  lääkkeiden sivuvaikutukset tärkeä kartoittaa

Kantasolut toksisuusmäärityksissä Lääkeainekokeilut: - Ylärivillä perustaso - 0.017 mg/ml isoprenalin - 14.3 mg/ml esmolol - 25 mg/ml esmolol Johtavuus: - sykintä alkaa elektrodista a - etenee b:n kautta c ja d d a b c

Kantasolut toksisuusmäärityksissä Control 100nM Noradrenaline

Kantasolut toksisuusmäärityksissä Muut hyödylliset kantasolumallit: Osteoblastit ja luukudos Adiposyytit ja rasvakudos Hepatosyytit ja maksakudos Erilaistumattomat kantasolut Hematopoieettiset kantasolut ja verisolujen tuotto Somaattiset in vitro solumallit Ihon fibroblastien käyttö kemikaalien syövyttävyys määrityksiin Ennen suoritettiin koe-eläimillä

Kantasolut toksisuusmäärityksissä Solujen yleisen stressiasteen mittaaminen toksisuustestauksessa Simmons et al. 2009;Toxicol. Sci.111(2):202-225 Solun reagointi stressiin ja siihen liittyvien muutosten määrittäminen Mahdollistaa integroidun testipaneelin (esim. 10 testiä) kehityksen Vrt. Yksittäisen spesifisen toiminnan mittaaminen Menetelmät haastavia Xenobiootit voi jäädä huomaamtta, koska niiden toksiset vaikutukset on moninaisia ja huonosti tunnettuja Solun stressiin liittyvät signaalireitit/indikaattorit ollut pitkään tutkimuksen alla Menetelmien automatisointi mahdollista Solun stressitilan määrittäminen Mallina herkät erilaistumattomat kantasolut Hyvä malli kemiallisten aineiden toksisuusmittauksiin Mitattavat parametrit: mitokondrion kunto, solun sisäinen ATP-taso, ROS-tasot, Genomisen DNA:n eheys etc.