Mikael Niku ELTDK / PELL / Anatomia, 2003 Histologisten tekniikoiden alkeet eli miten niitä leikkeitä oikein tehdään? Mikael Niku ELTDK / PELL / Anatomia, 2003 Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Näin se käy Parafiinileikkeet: Näytteenotto (pieniä kudoskappaleita) Kiinnitys l. fiksaus Valu parafiiniin Leikkaus ja asettelu objektilaseille Värjäys Jääleikkeet: Näytteenotto (pieniä kudoskappaleita) Nopea jäädytys esim. nestetypessä Leikkaus ja asettelu objektilaseille Kiinnitys l. fiksaus (esim. asetonissa) Värjäys Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Näytteenotto Histologisten tekniikoiden alkeet

Parafiinileikkeet 1: fiksaus, trimmaus ja pakkaus kasetteihin Fiksaus l. kiinnitys: fiksatiivi pysäyttää aineenvaihdunnan, säilöö kudoksen ja tekee siitä kestävämmän Trimmaus ja pakkaus Histologisten tekniikoiden alkeet

Parafiinileikkeet 2: valu Kudoskäsittelyautomaatissa etanolisarjan kautta sulaan parafiiniin Valu parafiini-blokiksi Valmiita blokkeja Histologisten tekniikoiden alkeet

Parafiinileikkeet 3: Leikkaaminen mikrotomilla Valomikroskopiaa varten näytteet leikataan tavallisimmin 1-10 m paksuiksi leikkeiksi. (Parafiiniblokkiin henkäistään kevyesti: se leikkaantuu paremmin hieman kosteana.) Histologisten tekniikoiden alkeet

Parafiinileikkeet 4: Leikkeet lasille Parafiinileikkeet vedestä, jääleikkeet suoraan. Parafiini-leikkeet kiinnitetään pinnoitetuille objektilaseille lämmittämällä . Valmista tuli! Histologisten tekniikoiden alkeet

Jää- l. kryoleikkeet 1: Näytteiden jäädytys Tuoreet kudospalat jäädytetään nopeasti nestetypessä tai hellemmin esim. nestetypessä jäähdytetyssä isopentaanissa ja säilötään ampulleissa syväjäässä. Histologisten tekniikoiden alkeet

Jää- l. kryoleikkeet 2: Leikkaaminen kryomikrotomilla Jäädytetty kudospala leikataan jäähdytetyssä erikoismikrotomissa. Leikkeet poimitaan suoraan pinnoitetuille laseille. Niiden annetaan kuivua huoneenlämmössä. Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Värjäys Värjäys voidaan tehdä joko käsin (vieressä) tai automaatilla (alla). Parafiini liuotetaan ensin pois ksyleenissä. Kuva: http://www.ucl.ac.uk/~rmkdhjh/autostnr.htm Histologisten tekniikoiden alkeet

Peitinlasien liimaus (peittäminen) Sitten vain mikroskopoimaan! Histologisten tekniikoiden alkeet

Perinteiset histologiset värjäykset Aikojen saatossa keksitty monia väriaine-tyyppejä ja lukemattomia väriaineita ja värjäysmenetelmiä Tuovat esiin kudoksen yleisen rakenteen tai sen tietyt osat Usein käytetään kahden värin yhdistelmää, esim. tumat tummalla ja solulima vaaleammalla värillä Molekyylitasolla melko epämääräisiä (värjäytyvät kohteet eivät yleensä ole spesifisiä molekyylejä, vaan tietynlaiset ominaisuudet omaavia) Silti edelleen erittäin tärkeitä esim. patologiassa Histologisten tekniikoiden alkeet

Perinteisiä histologisia värjäyksiä 1: Hematoksyliini-eosiini (HE) Yleisin väri kudosrakenteen osoittamiseen Tuma: sinisestä violettiin ja mustaan (hemateiini) Solulima: vaaleanpunaisen sävyt (eosiini) Sidekudossyyt: vaaleanpunainen Lihassyyt, luuaines: syvän vaaleanpunainen Punasolut: oranssinpunainen Suolen seinämää, HE Histologisten tekniikoiden alkeet

Perinteisiä histologisia värjäyksiä 2: Van Gieson (vG) Sidekudosväri Tuma: sinisestä mustaan Kollageeni: punainen Solulima, muut kudokset: keltainen Suolen seinämää, vG Histologisten tekniikoiden alkeet

histologisia värjäyksiä Muita perinteisiä histologisia värjäyksiä Resorsiinifuksiini: kimmosyyt Hopeanitraatti: eri menetelmillä esimerkiksi verkkosyyt tai hermosolujen aksonit Feulgen-reaktio: DNA vaaleanpunaisesta violettiin Sudan IV: lipidit oranssista punaiseen Histologisten tekniikoiden alkeet

Uudenaikaisempia värjäyksiä Saadaan näkyviin juuri haluttu kohdemolekyyli kudoksissa: Entsyymihistokemia: kudoksessa toimivat entsyymit Immunohistokemia: periaatteessa mikä tahansa kudoksessa oleva molekyyli In situ –hybridisaatio: tietty kudoksessa oleva DNA- tai RNA-jakso Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Immunohistokemia Käytetään vasta-ainetta, joka on tuotettu immunisoimalla eläin tutkittavaa molekyyliä vastaan  sitoutuu kudoksessa nimenomaan tähän molekyyliin Vasta-aine saadaan näkyväksi siihen kiinnitetyn leiman avulla (esim. fluoresoiva leima tai väriä tuottava entsyymi) Toimii myös elektronimikroskopiassa Erittäin herkkä menetelmä Kudoksen osasten tunnistus, toiminnan tutkiminen, patologinen diagnostiikka… Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Suolen seinämä, anti-sytokeratiini-IH (vastaväri: hematoksyliini) Suolen seinämä, anti-lihasaktiini-IH (vastaväri: hematoksyliini) Histologisten tekniikoiden alkeet

In situ -hybridisaatio Käytetään ns. koetinta: lyhyt DNA- tai RNA-pätkä, jonka emäsjärjestys vastaa tutkittavaa nukleiinihappojaksoa Koetin sitoutuu l. hybridisoituu kudoksessa DNA:han tai RNA:han, jonka emäsjärjestykseen se sopii Saadaan näkyväksi koettimessa olevan leiman avulla (fluoresoiva, entsymaattinen, radioaktiivinen…) Voidaan käyttää myös elektronimikroskopiassa Tarvittaessa viritettävissä erittäin herkäksi Geenien, kromosomien, solujen ja kudosten toiminnan tutkiminen, solujen tunnistaminen Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Freemartin-naudan suolen seinämän imukudosta, Y-kromosomi osoitettu ISH:lla Hiiren sikiön munuainen (E14,5), verisuonten endoteelin kasvutekijän lähetti-RNA osoitettu ISH:lla Histologisten tekniikoiden alkeet

Histologisten tekniikoiden alkeet Lisää tietoa Kirjastosta – sekä internetistä: Stains File - histotekniikkasivusto, jossa mm. erinomaiset selvitykset menetelmien kemiasta, tarkat tiedot väriaineista jne.: http://stainsfile.info/ Histologisten preparaattien valmistuksesta ja värjäyksistä (WebPath, Utahin yliopisto): http://www-medlib.med.utah.edu/WebPath/ HISTHTML/HISTO.html Kokoelma histologisia tekniikoita (Nottinghamin yliopiston histopatologian osasto): http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html Kokonaisia histologian kursseja: Kokoelma: http://zyx.freeservers.com/histo/links/histo2.htm Eläinlääketieteellistä histologiaa (Georgian yliopisto, College of Veterinary Medicine): http://www.vet.uga.edu/var/histo99/index.htm Ihmishistologiaa (Delawaren yliopisto): http://www.udel.edu/Biology/Wags/ histopage/histopage.htm Histologisten tekniikoiden alkeet