YHDISTELMÄ-DNA- TEKNIIKAN PERUSTEET Veli-Pekka Lehto Patologian laitos/HY

Käsiteltävät asiat Yleistä DNA:sta DNA-tekniikoiden keskeiset lähtökohdat ja piirteet Restriktioentsyymit DNA:n leimaaminen DNA:n kloonaaminen ja monistaminen Genomiset kirjastot PCR DNA fingerprinting DNA:n sekvensointi Globaalin geeniekspression tutkiminen Proteiinien tuottaminen DNA:n avulla Fuusioproteiinien tuottaminen Hiivan 2-hybridisysteemi Siirto- ja poistogeeniset eläimet Proteiinien muokkaaminen DNA:n hiljentäminen (RNAi-tekniikat)

”Central dogma” as outlined by Crick 1957, 1970 Solid arrows: probable information flow, Dotted arrows: possible information flow

DNA - kaksoiskierre, replikaatio

The Genetic Code

DNA:n perusrakenneosa Fosfaatti Sokeri emäs nukleotidi Kaksisäikeinen DNA DNA juoste Templaattiin perustuva uuden juosteen synteesi (polymerisaatio) DNA- kaksoiskierre sokeri- fosfaatti- runko vetysidoksin pariutuneet emäkset

Kaksisäikeinen DNA Vanha juoste (templaatti) Uusi juoste

DNA-synteesin peruspiirteet –deoksiribonukleotidi liitetään polynukleotidiketjun 3’- päähän –juoste kasvaa 5’-3’- suunnassa –templaattijuoste ohjaa synteesiä –syntyvä juoste on komplementaarinen templaattijuosteelle

Geenistä proteiiniksi –transkriptio –translaatio –post-translationaaliset modifikaatiot DNA:n synteesi (replikaatio, kahdentuminen) DNA:n synteesi (replikaatio, kahdentuminen) RNA:n synteesi (transkriptio) Proteiinisynteesi (translaatio)

EKSONIT JA INTRONIT Eukaryoottisolujen genomi koostuu eksoneista ja introneista eksonit: koodaavia alueita intronit: ei-koodaavia alueita intronit poistetaan ennen translaatiota > mRNA:ssa on ainoastaan eksoneita vastaavia sekvensseja

YHDISTELMÄ-DNA-TEKNIIKAT Keskeisiä lähtökohtia ja piirteitä DNA:n katkaiseminen määräpaikoista –Restriktioendonukleaasit (”bioleikkuri”) –mahdollistaa geenien eristämisen ja muokkaamisen DNA:n kloonaaminen –kloonausvektorit, monistaminen, PCR –mahdollistaa geenien kopioinnin ja miljardien identtisten geenien tuottamisen

YHDISTELMÄ-DNA-TEKNIIKAT Keskeisiä lähtökohtia ja piirteitä Sekvensointi –mahdollistaa geenien tunnistamisen ja niiden koodaamien proteiinien aminohappojärjestyksen määrittämisen Globaalin geeniekspression tutkiminen soluissa/kudoksissa –mikrosiru/DNA chip-tekniikka –kymmenien tuhansien hybridisaatioreaktioiden samanaikainen suorittaminen

Restriktioendonukleaasit leikkaavat kaksisäikeisen DNA:n määräpaikoista –blunt end, staggered end, cohesive ends tunnistavat 4-8 nukleotidin jaksoja ”Cohesive” päät voivat pariutua (”annealing”) –mahdollistaa DNA-sekvenssien yhdistelyn –yhdistelmä-DNA (rekombinantti DNA)

annealing (pariutuminen) Eri restriktioendonukleaasit tunnistavat erilaisia sekvenssejä Restriktioendonukleaasien pilkkomia DNA-jaksoja voidaan liittää toisiinsa

Geelielektroforeesissa DNA-fragmentit voidaan erotella koon perusteella polyakryyliamidigeeli –erottelee yksisäikeisen DNA:n – nukleotidia –erottelukyky 1 nt –käytetään erityisesti sekvensoinnissa Agaroosigeeli –erottelee kaksisäikeisen DNA:n – bp –analyyttiset ja preparatiiviset tarkoitukset Pulse-field.geelielektroforeesi –voidaan erotella jopa kromosomeja

DNA:n LEIMAAMINEN Mm. koettimien tuottamiseksi hybridisaatiorektioita varten (probes) Radioaktiivinen leimaus –radioaktiivisen komponentin (esim. 32P) inkorporoiminen DNA- ketjuun synteesin aikana (A, seur. dia) –pääteleimaus (B, seur. dia) Ei-radioaktiivinen leimaus –modifioidut nukleotidit, esim. digoksigeniini tai fluorokromi (ks. C, seur. dia) –inkorporoidaan DNA-ketjuun –tunnistetaan vasta-aineen avulla tai fluoresoivassa valossa

Puhdistettu DNA:n restriktiofragmentti Denaturoi ja anna hybridisoitua heksanukleotidiseoksen kanssa Lisää DNA-polymeraasi ja leimatut nukleotidit DNA polymeraasi liittää leimatut nukleotidit syntyviin DNA-säikeisiin Puhdistettu DNA:n restriktiofragmentti DNA:n 5’-pää leimataan käyttäen polynukleotidikinaasia ja 32P-leimattua ATP:a Restriktionukleaasin avulla katkaistaan DNA fragmenteiksi Fragmentit eristetään geeli- elektroforeesilla Puhdistetaan haluttu DNA-fragmentti, jossa toinen säie on leimattu Digoksigeniini ”spacer” Modifioitu nukleosiditrifosfaatti A) B) C)

HYBRIDISAATIO Mahdollistaa DNA-jaksojen tunnistamisen Kaksisäikeisen DNA:n kaksoiskierre avautuu 100C-asteen lämpötilassa tai pH>13 (denaturaatio) 65 C-asteen lämpötilassa vastinsäikeet pariutuvat (hybridisaatio, renaturaatio) Hybridisaatio voi tapahtua: DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA

Genetic Similarities: Wilson, Sarich, Sibley, and Ahlquist

HYBRIDISAATIO Vastinsekvenssien toteamiseksi/löytämiseksi käytetään leimattuja yksisäikeisiä koettimia (probes) –täydellinen tai osittainen hybridisaatio mahdollistaa identtisten tai samankaltaisten sekvenssien tunnistamisen (match) –mahdollistaa DNA:n tai RNA:n määrän kvantitoinnin Geenien ilmentymisen tutkimisen eksoni-introni-rajojen tunnistamisen

Hybridisaatio 42 C-asteen lämpötilassa 50%:ssa formamidissa Yksisäikeiset DNA-koettimet (probes) geenille A Seos erilaisia yksisäikeisiä DNA-molekyylejä Hybridisaatio 35 C-asteen lämpötilassa 50%:ssa formamidissa Ainoastaan A muodostaa parin koettimen kanssa A, C ja E muodostavat pareja koettimen kanssa

eksoni 1 introni eksoni2 mRNA Denaturoi DNA ja hybridisoi RNA:n kanssa Intronisekvenssi Hajoava DNA S1-nukleaasi hajottaa yksisäikeisen DNA:n eksoni 1 eksoni 2 Kloonattu genominen DNA Käsittelemätön DNA (kontrolli) Alkalinen geeli- elektroforeesi

Southern- ja northern blotting ja hybridisaatio ”Southern” –DNA pilkotaan restriktioentsyymillä ja fragmentit erotellaan geelielektroforeesissa ”Northern” –RNA erotellaan intaktina geelielektroforeesissa Geelissä erottuneista ”bändeistä” tehdään replika nitroselluloosafiltterille Hybridisaatio leimatulla koettimella Autoradiografia

Southern blotting

northern blotting

Restriction map Southern blotting-tekniikan sovellus, jossa selvitetään tutkittavan DNA:n restriktiofragmenttien pituudet Kartan perusteella voidaan tunnistaa esim. pistemutaatioiden olemassaolo silloin kun ne esiintyvät restriktioentsyymin tunnistuskohdan alueella

Leimaamaton RNA tai DNA Määrämittainen leimattu RNA tai DNA vertailunäytteenä agaroosigeeli sieni alkalinen puskuri nitroselluloosapaperi geeli DNA- TAI RNA-FRAGMENTIT EROTELLAAN KOON PERUSTEELLA AGAROOSIGEELI- ELEKTROFOREESISSA SÄHKÖKENTÄSSÄ EROTELLUT DNA-/RNA-FRAGMENTIT SIIRRETÄÄN NITROSELLULOOSAPAPERILLE KAPILLAARI-IMUN AVULLA NITROSELLULOOSAPAPERI, JOSSA DNA/RNA-FRAGMENTIT OVAT KIINNI, POISTETAAN ANNETAAN LEIMATUN KOETTI- MEN HYBRIDISOITUA DNA:n/RNA:n KANSSA leimattu koetin puskurissa suljettu muovipussi LEIMATTU KOETIN HYBRIDISOITUU KOMPLE- MENTAARISEN SEKVENSSIN KANSSA VISUALISOIDAAN AUTORADIOGRAFIAN AVULLA leimatut ”bändit”vertailumateriaali pino paperipyyhkeitä

In situ hybridisaatio (ISH) DNA:n tai RNA:n tunnistaminen kromosomeissa, soluissa ja kudoksissa leimattujen koettimien avulla Mahdollistaa geenien ja RNA:n paikantamisen ja tutkimisen suhteessa esim. solujen rakenteisiin - Kromosomi 5, metafaasi - Kuusi erilaista leimattua koetinta - Detektio fluorokromeilla leimatuilla vasta-aineilla

DNA:N KLOONAUS Tarkoittaa sekä tietyn DNA-jakson (usein geeni) eristämistä että sen monistamista –monistaminen kloonausvektorin avulla –eristäminen DNA-kirjastosta –eristäminen/monistaminen polymeraasiketjureaktion (polymerase chain reaction, PCR) avulla

DNA:N KLOONAUS Monistaminen kloonausvektorin avulla –monistettava DNA liitetään virukseen tai plasmidiin, joilla on kyky replikoitua itsenäisesti (kloonausvektorit) –Konstrukti siirretään bakteerisoluun –Laajennetaan bakteerikasvustoa –Harvestoidaan vektori-DNA

Rengasmainen kaksisäikeinen plasmidi DNA (kloonausvektori) Kloonattavaksi tarkoitettu DNA-fragmentti KATKAISE RESTRIKTIO- ENTSYYMILLÄ KYTKE YHTEEN DNA-LIGAASIN AVULLA Yhdistelmä DNA (rekombinantti DNA)

DNA:n kloonaus

Kaksisäikeinen yhdistelmä (plasmidi) DNA siirretään bakteerisoluun Bakteerisolu Soluviljelmässä tuotetaan satoja miljoonia bakteerisoluja Plasmidi DNA puhdistetaan hajotetuista bakteerisoluista

DNA:N KLOONAUS Eristäminen DNA-kirjastosta –genomisen DNA:n kirjasto koostuu genomisen DNA:n jaksoista vain pieni osa jaksoista sisältää kokonaisen geenin mukana myös ei-koodaavia DNA-jaksoja –cDNA-kirjasto koostuu cDNA-jaksoista, joiden templaattina on mRNA kirjastossa edustettuina kaikki ilmennetyt geenit vain DNA:n koodaavat osat edustettuina

Genomisen DNA:n kirjaston luominen Ihmisen kaksisäikeinen DNA KATKAISU RESTRIKTIO- ENTSYYMEILLÄ DNA FRAGMENTIT LIITETÄÄN PLASMIDIIN Yhdistelmä DNAt PLASMIDIT SIIRRETÄÄN BAKTEERISOLUIHIN Miljoonia genomisen DNA:n fragmentteja GENOMISEN DNA.N KIRJASTO

kudos (esim aivo) HAJOTA SOLUT JA ERISTÄ mRNA HYBRIDISOI POLY(T)-ALUKKEEN KANSSA TEE DNA-KOPIO KÄYTTÄMÄLLÄ KÄÄNTEISKOPIOIJAENTSYYMIÄ HAJOTA RNA RnaseH- ENTSYYMILLÄ SYNTETISOI KOMPLEMENTAARINEN DNA-SÄIE KÄYTTÄEN DNA-POLYMERAASIENTSYYMIÄ; RNA FRAGMENTIT TOIMIVAT ALUKKEINA KAKSISÄIKEINEN cDNA; ALKUPERÄISEN mRNA:n KOPIO

Ekspressiokloonaus Käytetään vektoria, joka mahdollistaa DNA:n koodaaman proteiinin ilmentämisen/tuoton. Voidaan luoda “ekspressiokirjasto”

PCR Polymerase Chain Reaction, polymeraasiketjurektio Monien eri lajien genomin tultua sekvensoiduiksi, geenejä voidaan kloonata PCR:n avulla suoraan ilman kirjastoseulontaa Valitaan ja syntetisoidaan sopivat alukkeet (primers), jotka hybridisoituvat määräpaikkoihin ja ohjaavat DNA-synteesiä Termofiilinen DNA polymeraasi Usein sykliä riittävä Mahdollistaa ”cell free”-kloonauksen Syrjäyttänyt Southern blottingin esim. mutaatioiden toteamisessa ja virusdiagnostiikassa Käytetään hyväksi esim. rikostutkinnassa ja uhrin tunnistuksessa (”DNA fingerprinting”)

PCR:N PERIAATE JA SUORITTAMINEN

PCR:n avulla voidaan DNA-jaksoja kloonata/monistaa helposti sekä genomisista että cDNA-kirjastoista

DNA fingerprinting Perustuu PCR:on Sovelletaan rikostutkinnassa ja uhrintunnistuksessa Perustuu siihen, että tietyt toistojaksot (hypervariable microsatellite sequences, variable number of tandem repeats/VNTR) esiintyvät eri yksilöiden genomeissa eri pituisina Kullakin yksilöllä on vanhemmilta perittyinä erilaiset toistoalueet Valittuja toistojaksoalueita monistetaan ja niiden pituus määritetään 5-10 eri toistojakson analysointi mahdollistaa tunnistamisen virhetodennäköisyydellä 1/

SAMA PROFIILI DNA FINGERPRINTING

fingerprinting/ (There are many other cases of people released from jail after being cleared by DNA fingerprinting. See a list of some of them here: )

DNA:N SEKVENSOINTI Sekvensointi: DNA:n emäsjärjestyksen määrittäminen Dideoksitekniikka –Perustuu dideoksiribonukleosiditrifosfaattien käyttöön. Inkorporoituessaan syntyvään säikeeseen ne estävät säikeen pitenemisen Sekvenssin perusteella voi ennustaa/päätellä proteiinin aminohappojärjestyksen –avoin lukukehys (open reading frame, ORF) –start codon: ATG –stop codon: TAA, TAG, TGA cDNA:sta ORF on tunnistettavissa suoraan Genomisessa DNA:ssa on tunnistettava eksonit intronialueista

DNA:N SEKVENSOINTI

Automaattinen sekvensointi

LUKUKEHYKSEN MÄÄRITTÄMINEN

Moore ’ s Law and DNA sequencing

NATURE | NEWS FEATURE Sharing Technology: The $1,000 genome With a unique programme, the US government has managed to drive the cost of genome sequencing down towards a much-anticipated target. Erika Check Hayden 19 March 2014

Ion Semiconductor Sequencing

GLOBAALI GEENIEKSPRESSIO Tutkimuskohteena –solun koko genomin ekspressio ja sen muutokset erilaisissa fysiologisissa olosuhteissa –geeniekspression erot normaalien ja esim. syöpäsolujen välillä mekanismien tutkiminen luokittelu diagnostiikka Voidaan tutkia DNA-mikrosirutekniikan avulla

DNA MIKROSIRUT Mahdollistavat tuhansien geenien ilmentymisen tutkimisen samanaikaisesti

Klusterianalyysi - käytetään hyväksi DNA sirutekniikkaan perustuvassa geeni- ekspression analysoinnissa - esim tutkitaan geeniekspression muutosta ajan funktiona soluissa, joille tarjotaan kasvun kannalta tärkeitä ravinteita - Tutkitut geenit ryhmitellään niiden ekspressiovasteen mukaan - Analyysi voi paljastaa tutkittavan funktion kannalta tärkeitä säätelyreittejä

PROTEIININ TUOTTAMINEN EKSPRESSIOVEKTORIN AVULLA Ekspressiovektorin avulla voidaan tuottaa proteiinia ilman työläitä perinteisiä biokemiallisia puhdistusvaiheita Ekspressiovektorit ovat yleensä muokattuja plasmideja, joiden toimintaa voidaan säädellä esim. lämpötilan avulla Tuottoisäntiä voivat olla esim. bakteerit, hiiva, hyönteissolut, nisäkässolut Proteiinin puhdistamisessa voidaan käyttää hyväksi ”tagia”, joka on liitetty proteiiniin geeniteknisin menetelmin ja joka mahdollistaa esim. affiniteettipuhdistuksen

Kaksisäikeinen plasmidi DNA (ekspressiovektori) promoottorisekvenssi KATKAISE DNA RESTRIKTIOENTSYYMILLÄ LIITÄ VEKTORIIN HALUTTU PROTEIINIAKOODAAVA DNA SIIRRÄ rDNA TUOTTOSOLUUN yliekspressoitu mRNA yliekspressoitu proteiini

Proteiinin tuotto ekspressiovektorin avulla –tuottovektorissa helikaasin geeni –tuottoa ohjaa lämpöherkkä promoottori, joka toimii > 37 C

rDNA-tekniikan avulla tuntemattoman proteiinin luonne ja ominaisuudet voidaan selvittää aikaisempaa vaivattomammin ”geenin kautta”.

FUUSIOPROTEIINIT PROTEIINIEN FUNKTIOIDEN JA SIJAINNIN TUTKIMISESSA Liitetään proteiinia koodaavaan geeniin/tuottovektoriin ”tag”, joka on esim. –tunnistettavissa vasta-aineella –fluoresoiva (esim green fluorescent protein, GFP) ”tag” tekee mahdolliseksi –proteiinin puhdistamisen –paikallistamisen –käytön proteiini-proteiini- interaktioiden tutkimisessa

Hiivan 2-hybridisysteemi Käytetään proteiini- proteiini-interatioiden tutkimisessa –Tutkittavan (bait) ja erikseen tai kirjastosta ilmennetyn proteiinin (prey)interaktio tuo yhteen transkriptiokoneiston osat niin, että ”reportterigeeni” ilmentyy –”Reportterin” perusteella voidaan tunnistaa klooni, jossa interaktoiva proteiini (prey) ilmentyy

Phage display-kirjasto - käytetään erityisesti proteiini-proteiini-interaktioiden tutkimisessa - mahdollistaa esim. miljardien synteettisten peptidisekvenssien seulonnan lyhyessä ajassa

Siirto- ja poistogeeniset eläimet - mahdollistavat geenifunktion tutkimisen in vivo

PROTEIINIEN MUOKKAAMINEN - synteettisen alukkeiden avulla proteiineja koodaavia geenejä voidaan muokata halutulla tavalla esim. koodaamaan toiminnaltaan vajavaisia tai parannettuja entsyymejä

EPIGENETIIKKA Geenisäätely, joka ei perustu DNA:n emäsjärjestykseen –Sytosiiniemästen metylaatio –Histoniproteiinien asetylaatio ja metylaatio –mikroRNA-vaikutukset Solutyyppikohtainen Dynaamisuus

RNA:N HILJENTÄMINEN l. RNA- INTERFERENSSI Transkription jälkeen tapahtuva kohdennettu geeniekspression estäminen Tutkittavaa geeniä vastaava kaksijuosteinen RNA viedään soluihin pienissa pätkissä –siRNA (small inhibitory RNA) Vastaava mRNA pilkkoutuu ja geenin ekspressio estyy

”Classic” –tunnista proteiini –tunnista geeni ”Reverse” –tunnista geeni –tunnista proteiini

DNA Computing DNA molekyylit suorittamassa rinnakkaislaskentaa 1994 Leonard M. Adelman käytti DNA- fragmenttien pariutumista liuoksessa ratkaisemaan NP-täydellisen graafiteoreettisen ongelman (seven-node instance of a Hamiltonian path)

ScienceNews

Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns Paul W. K. Rothemund Nature 440, March 2006

Thanks!

DNA Computing DNA molekyylit suorittamassa rinnakkaislaskentaa 1994 Leonard M. Adelman käytti DNA- fragmenttien pariutumista liuoksessa ratkaisemaan NP-täydellisen graafiteoreettisen ongelman (seven-node instance of a Hamiltonian path)

Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns Paul W. K. Rothemund Nature 440, March 2006