VAIHTOEHTOINEN SILMUKOINTI

Esitys aiheesta: "VAIHTOEHTOINEN SILMUKOINTI"— Esityksen transkriptio:

1 VAIHTOEHTOINEN SILMUKOINTI
RNA:N SILMUKONTI VAIHTOEHTOINEN SILMUKOINTI

2 pre-mRNA:n silmukointi
pre-mRNA koostuu introneista ja eksoneista RNA:n silmukointi = intronien poisto Yhdessä silmukointitapahtumassa poistetaan yksi introni Eksonit (expressed sequences) = koodaavat alueet, suhteellisen vähän Intronit (intervening sequences) = ei-koodaavat alueet Silmukointitapahtumassa tapahtuu kaksi peräkkäistä transesterifikaatiota. Intronia poistettaessa samalla yhdistetään myös eksonit, introni poistuu lariat/lasso-rakenteena. Introni lopulta hajoaa (degrade). Joustava, koska eukaryoottisoluissa valtava määrä introneita. Jos silmukoinnissa tapahtuu virheitä, solu yleensä kärsii.

3 Silmukoinnin hyödyt organismille
Eksoni-introni-yhteenliittymä helpottaa uusien proteiinien ilmestymistä Useat intronit sallivat geneettisen rekombinaation Vaihtoehtoinen silmukointi - erilaisia mRNA-molekyylejä -> samasta geenistä useita proteiineja Geneettinen rekombinaatio: eri geenien eksoneita yhdistellään.

4 Silmukointisignaalit
Intronit eri pituisia, nukleotidia Introni-sekvenssin poistamiseen liittyy 3 kohtaa RNA:ssa - 5’-silmukointikohta - 3’-silmukointikohta - haarautumiskohta - jokaisella on samanlainen sekvenssi jokaisessa intronissa Eksonit (expressed sequences) = koodaavat alueet, suhteellisen vähän Intronit (intervening sequences) = ei-koodaavat alueet Silmukointitapahtumassa tapahtuu kaksi peräkkäistä transesterifikaatiota. Intronia poistettaessa samalla yhdistetään myös eksonit, introni poistuu lariat/lasso-rakenteena. Introni lopulta hajoaa (degrade). Joustava, koska eukaryoottisoluissa valtava määrä introneita. Jos silmukoinnissa tapahtuu virheitä, solu yleensä kärsii. Moni, varsinkin autoimmuuni-, tauti liittynee väärin tapahtuvaan vaihtoehtoiseen silmukointiin. Esim. (1. tyypin diabetes, myotonic dystrophy (joku lihaksiston rappeutumissairaus)) Intronien rajoja vaikea määrittää, kuitenkin 99,24 %:lla introneista on GT sekvenssi 5’-päässä ja AG 3’-päässä[*] * Burset, M., Seledtsov, I.A. & Solovyev, V.V. Analysis of canonical and non-canonical splice sites in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 28, 4364–4375 (2000).

5 silmukointi snRNA-pätkät auttavat tarttumaan oikeisiin kohtiin intronin alkuun ja loppuun A:lla merkitty kohta on haarautusmiskohta snRNA-molekyylejä: U1, U2, U4, U5, U6 - tunnistavat intronin ja eksonin rajan - osallistuvat silmukointiin snRNA + 7 proteiinia -> snRNP Spliseosomi hoitaa silmukoinnin - RNA:ta ja proteiineja snRNA:t toimivat osana spliceosomeja ja katalysoivat näin mRNA–prekursoiden splissauksen. snRNP eli small nucleal ribonucleoproteins. Silmukointiin liittyvää. U1 snRNAssa on sekvenssi joka on komplementaarisen silmukoitavan intronin 5’ pään kanssa. Tämä auttaa sitten itse spliceosomia kiinnittymään oikeaan paikkaan. U2 taasen tarttuu tiettyyn kohtaan intronia lähelle sen 3’ päätä. U2:N emäsjärjestys saa adenosiinin työntymään hieman ”ulos”. Tämä adenosiini käy sitten hieman läpi kemiallista modifikaatiota muodostaen myöhemmin lasson. kuva Biochemstry 5th edition (2002, J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer)

6 kuva Biochemstry 5th edition (2002, J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer)
spliceosomin kokoaminen koostuu useasta askeleesta. Ensiksi U1 ja U2 snRNP:t sitoutuvat, sen jälkeen muut snRNP:t (U4/U6-kompleksi ja U5) muodostavat epäaktiivisen spliseosomin. Sisäisen järjestelyn jälkeen U1 ja U4 lähtevät ATP:n voimalla pois ja U6 sitoutuu 5’ silmukointipäähän sekä U2:een jolloin muodostuu aktiivinen spliceosomi joka sitten silmukoi intronin pois ja irtoaa siis itsekin. Haarautumiskohta = muodostaa lasson perustan Intronien rajoja vaikea määrittää, kuitenkin 99,24 %:lla introneista on GT sekvenssi 5’-päässä ja AG 3’-päässä[*] * Burset, M., Seledtsov, I.A. & Solovyev, V.V. Analysis of canonical and non-canonical splice sites in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 28, 4364–4375 (2000). RNA-molekyylit suhteellisen lyhyitä, ~200 nukleotidia snRNA = small nuclear RNA snRNP = small nuclear ribonucleoprotein, muodostavat spliseosomin ytimen kuva Biochemstry 5th edition (2002, J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer)

7 Vaihtoehtoinen silmukointi
Solujen tapa vaihtaa geenien ekspressiota -> erilaisia proteiineja samasta geenistä Tärkeä rooli fysiologiassa ja tautien tutkimisessa 40-60% ihmisen geeneistä Proteiinien monimuotoisuuden tärkeä ”lähde” ** Erilaisia polypeptidiketjuja/proteiinien eri muotoja samasta geenistä. AS tuottaa erilaisia proteiineja, jotka eroavat sekvenssiltään, rakenteeltaan ja toiminnaltaan. Genomisesta DNA:sta kopioituun pre-mRNA:han vaikuttavat vaihtoehtoisen silmukoinnin mekanismit, jonka takia eksonit joko jäävät RNA:han tai niitä poistetaan, jolloin voi jäädä erilaisia kombinaatioita lopulliseen mRNA:han. Tämän ohjeiden mukaan syntyy sitten erilaisia proteiineja, joilla on erilaisia vaikutuksia – jopa vastakkaisia. AS = säädelty prosessi, jossa pre-mRNA:n alueita, joka poistetaan tai otetaan mukaan, jolloin syntyy erilaisia yhdistelmiä. AS:ää säädellään usein ajallisesti tai kudoksen mukaan, jolloin syntyy erilaisia proteiinimuotoja eri kudoksissa ja eri vaiheessa kehitystä. Korkeimmista eukaryoottigeeneistä huomattava osa (40-60% ihmisen geeneistä, tiedot vaihtelevat) tuottaa useita proteiineja vaihtoehtoisella silmukoinnilla. Kun erilaisia silmukointimahdollisuuksia on pre-mRNA:n useissa kohdissa, yksi geeni voi tuottaa kymmeniä erilaisia proteiineja.

8 AS:n vaikutusalueet AS:n vaikutuksia RNA:n ei-koodaaviin alueisiin: voi johtaa muutoksiin esim. säätelyelementeissä, kuten translaation ”laajentajissa” tai RNA:n stabiilisuusalueilla, joilla voi olla suuri vaikutus proteiinien ekspressioon. Suurin osa, ¾ AS:stä muuttaa proteiinia koodaavia alueita, vähemmän ei-koodaavia 5’ ja 3’ UTR:iä. Kuva: AS voi tapahtua millä alueella tahansa kehittyvässä mRNA:ssa, 3’ tai 5’ ei-koodaavilla alueilla, UTR = untranslated regions tai proteiinia koodaavassa sekvenssissä. 5’ UTR sekvenssi sisältää säätelyalueita, jotka kontrolloivat proteiiniekspressiota. Näiden alueiden lisäys tai poisto vaikuttaa proteiinin tuotantoon. 3’ UTR alue sisältää lähetti-RNA:n stabiilisuusalueita. Näiden alueiden lisäys tai poisto vaikuttaa mRNA:n stabiilisuuteen ja siten proteiiniekspressioon. AS proteiinia koodaavassa sekvenssissä vaikuttaa proteiinin rakenteeseen ja toimintaan.

9 Vaihtoehtoisen silmukoinnin neljä muotoa
Jokaisessa tapauksessa 2 vaihtoehtoista tapaa tuottaa 2 eri mRNA:ta. Siniset eksonit jäävät kumpaankin mRNA:han. Vaaleansiniset eksonit vain toisessa mRNA:ssa. Punaiset viivat kertovat, mitkä sekvenssit poistetaan. (1) Eksoni skipataan (2) 5’- or 3’-terminal exon changes, resulting in the alternative usage of promoters or alternative polyadenylation (3) intron removal or retention (4) the alternative usage of splice sites 1-4 vaikutuksia geenituotteisiin: ne voivat turn on tai off geeniekspression poissulkemalla tai ottamalla mukaan stop kodonin tai ne voivat muuttaa proteiinien rakennetta tai toimintoa lisäämällä tai poistamalla joitakin aminohappoja. Ne voivat muuttaa RNA:n stabiiliutta vaihtamalla ei-koodaavia rakenteita. Joissakin tapauksissa proteiinien toiminnalliset muutokset korreloivat suoraan jonkin sairauden kanssa, joka on usein syöpä.

10 Intronin moniselitteisyys
Spliseosomi mekanismi, joka poistaa intronin ei pysty selkeästi erottamaan kahdesta tai useammasta 5’ ja 3’ silmukointikohtien vaihtoehtoisesta pariutumisesta Valinnat tehdään sattumalta ** Intronin sekvenssin moniselitteisyys on yksi syy, että AS tapahtuu. Erilaiset valinnat tapahtuu sattumalta eri pre-mRNA:issa. Kun tällainen perustava vaihtoehtoinen silmukointi tapahtuu, geenin koodaamia proteiinien useita versioita valmistetaan kaikissa soluissa, jossa geeni ekspressoituu.

11 AS on yleensä säädelty Voi olla myös perustava
Säädeltyä silmukointia käytetään - ei-toiminnallisen proteiinin tuotannosta toiminnallisen proteiinin tuotantoon - tuottamaan proteiinin eri versioita eri solutyypeissä AS on monipuolinen mekanismi verrattuna tiukasti säädeltyyn geeniekspressioon ** Edellinen slide perustava AS Eri versioita eri solutyypeissä solun tarpeiden mukaan. Monien proteiinien solutyyppispesifiset muodot tuotetaan samalla tavalla. Tropomysiiniä tuotetaan erikoistuneissa muodoissa eri tyyppisissä soluissa. Mitä toi viimeinen pointti tarkoittaa?

12 Säädelty AS Säätelymolekyyli Negatiivisesti Positiivisesti
Herkkä tasapaino kilpailevien silmukointikohtien välillä Neg: säätelymolekyyli, joka estää silmukointikoneistoa pääsemästä tiettyyn silmukointikohtaan RNA:ssa. Posit: säätelymolekyyli, joka auttaa ohjaamaan silmukointikoneiston sellaisen kohtaan, josta muuten ei välitettäisi/jota ei huomioitaisi RNA silmukoinnin plastisuudesta/muokattavuudesta johtuen, ”vahvan” silmukointikohdan blokkaus altistaa ”heikon” kohdan, jolloin erilaista silmukointia tapahtuu. Samoin, puolioptimaalisen silmukointikohdan aktivointi johtaa kilpailevan kohdan ehkäisyyn pre-mRNA-molekyylin silmukointi voidaan ajatella herkkänä tasapainona kilpailevien silmukointikohtien välillä – tasapaino, jonka säätelyproteiinit voivat helposti muuttaa

13 Negatiivinen kontrolli:
Estävä proteiini sitoutuu primääriseen RNA:han kudoksessa 2 ja siten estää silmukointikoneistoa poistamasta intronisekvenssiä. (B) Positiivinen kontrolli: Silmukointikoneisto ei pysty tehokkaasti poistamaan tiettyä intronisekvenssiä ilman aktivaattoriproteiinin apua.

14 AS:n kontrollointi Proteiinien sitoutuminen -> erilainen silmukointi Laajentaja-sekvenssi (enhancer) Tukahduttaja-sekvenssi (suppressor) AS:ää kontrolloi/tapahtuu, kun trans-acting-proteiinit sitoutumalla cis-acting-sekvensseihin pre-mRNA:ssa, joka johtaa silmukointikohtien erilaiseen käyttöön. Monia sekvenssejä on identifioitu ja ryhmitelty joko laajentajiksi (enhancer) tai tukahduttajiksi (suppressor). Nämä elementit ovat tavallisesti lyhyitö (8-10 nukleotidia). Vaihtoehtoisen silmukoinnin paikkojen tunnistuksen kontrolliin osallistuu SR (serine rich) proteiiniperhe, jotka ovat silmukointitekijöitä, jotka sitoutuvat laajentaja ja tukahduttaja elementteihin. Näiden vaikutusta pre-mRNA:han ja snRNP-proteiineihin on tutkitaan. Niiden rooli slimukointikohdan valinnan säätelyssä uskotaan tapahtuvan kahdessa (ehkä ei toisensa poissulkevassa) moodissa – arginine-serine (RS) domaani riipuvainen ja RS domaani riippumaton. 1. Heikko silmukointikohta vahvistuu 2. inhibointi

15 AS historiaa Gilbert (1978): miksi geenit ovat palasina?
Ensimmäiset geenit (ihminen) 1980, 1982 Geenin määritelmää täytyi muuttaa, kun AS löydettiin 1970-luvulla löydettiin, että eksoneista ja introneista muodostuu lopullinen geenin transkriptiotuote, mRNA RNA:n silmukoinnin vaikutuksesta (Gilbert 1978). Muutama vuosi tämän jälkeen löydettiin geenisäätelyn lisätaso: AS. Ekaksi luultiin, että AS on erityinen ilmiö, joka vaikuttaa vain pieneen osaan geeneistä. Nyt kuitenkin tiedetään, että merkittävä määrä geenejä hyödyntää AS -> geneettinen monimuotoisuus. AS:n konsepti syntyi, kun Gilbert esitti kysymyksen ”miksi geenit ovat palasina?”. Tätä seurasi, että 2 ihmisen geeniä, immunoglobuliinia koodaava ja kalsitoniinia koodaava, identifioitiin ja huomattiin että ne kokevat AS:n. Geenin määritelmää täytyi muuttaa, kun AS löydettiin/keksittiin: 1940-luvulla geeni määr. Neurospora-sienen biokemialliseen genetiikkaan perustuvan työn perusteella. Geeni määr. toiminnallisesti genomin alueena, joka erottaa yhden yksikön meioosin aikana ja johtaa määriteltävän fenotyypin syntyyn (silmien väri). Neurosporan tutkimukset näyttivät, että useimpia geenejä vastaa genomin alue, joka koodaa yhden entsyymin syntyä -> hypoteesi: yksi geeni koodaa yhtä polypeptidiketjua. luvulla: geeni = DNA:n pätkä, joka muutetaan RNA:ksi, joka koodaa yhtä polypeptidiketjua luvulla intronit ja split-geenit löydettiin, sovitettiin alkup. määritelmään 4. Nykyään monet korkeampien eukaryoottien DNA-sekvenssit voivat tuottaa erillisten proteiinien sarjan/setin AS:n kautta. Geeni = DNA-sekvenssi, joka käännetään yksittäiseksi RNA:ksi ja koodaa toisiaan lähellä olevien polypeptidiketjujen joukkoa (proteiini-isoformit). Otetaan huomioon transkription jälkeiset prosessit.

16 AS eri lajeilla Drosophila-geeni voi tuottaa erilaista proteiinia yhdestä geenistä Harvinainen yksisoluisella hiivalla Yleistä kärpäsillä Geenien lukumäärä ei välttämättä kerro organismin kompleksisuutta Drosophila = banaanikärpänen, vain pieni osa havaittu kokeellisesti. Yhteensä geeniä -> proteiinien määrä ylittää selvästi geenien määrän. Yksisoluinen hiiva: 6200 geeniä, 327 silmukoidaan ja lähes kaikissa on vain yksi introni. Kärpäset: 2-3 kertaa enemmän geenejä kuin hiivalla Organismi voi olla paljon kompleksisempi AS:n johdosta kuin geenien lukumäärästä voisi päätellä.

17 Banaanikärpäsen DSCAM-geeni
Drosophilan/banaanikärpäsen DSCAM-geenin vaihtoehtoinen silmukointi: Lopullinen mRNA sisältää 24 eksonia joista 4 (A, B, C, D) sijaitsee DSCAM-geenissä vaihtoehtoisten eksonien joukkona. Jokainen RNA sisältää yhden A: 12 vaihtoehdosta, 1 B:n 48:sta, 1 C:n 33:sta ja 1 D: kahdesta. Jos kaikki mahdolliset silmukointikombinaatiot otetaan huomioon, erilaista proteiinia voidaan periaatteessa tuottaa DSCAM-geenistä. Jokainen erilainen DSCAM-proteiini laskostuisi karkeasti samanlaiseksi rakenteeksi, mutta domainien aminohapposekvenssit vaihtelisivat silmukointikuvion mukaan. DSCAM-proteiinit ovat aksonin ohjaus reseptoreja, jotka auttavat ohjaamaan kasvuconet oikeisiin kohteisiin kehittyvässä hermostossa. On mahdollista, että tämä reseptori-monimuotoisuus vaikuttaa kompleksisten hermoratojen muodostumiseen, mutta monien DSCAM-muotojen tarkkoja ominaisuuksia ja toimintoja ei vielä ymmärretä.

18 Banaanikärpäsen sukupuolen määritys
Riippuu silmukointitapahtumien säätelystä Kolme geenituotetta Banaanikärpäsen sukupuolen määritys on parhaiten ymmärrettyjä esimerkkejä säädellystä RNA:n silmukoinnista. Vaikka tämä on yksi parhaiten ymmärretyistä esimerkeistä perustuen säädeltyyn RNA-silmukointiin, ei ole selvää, miksi kärpäsen pitäisi käyttää tätä strategiaa. Muut organismit käyttävät täysin erilaista skeemaa sukupuolen määritykseen, joka perustuu transkriptionaalisiin ja translaationaalisiin kontrolleihin. Sukupuolen määritys riippuu säädellyistä RNA:n silmukointitapahtumista, joihin liittyy kolme geenituotetta.

19 1. dsx = doublesex Sxl = Sex-lethal tra = transformer
Oletuksena on, että kärpäsestä tulee uros Ensimmäinen signaali, josta riippuu, kehittyykö kärpäsestä uros vai naaras, on X kromosomien suhde autosomeihin. Jos se on 1 (normaalisti 2 X ja 2 settiä autosomeja), kehittyy naaras. Jos se on ½ (normaalisti 1 X ja 2 settiä autosomeja), kehittyy uros. Tämä suhde arvioidaan aikaisin/alkuvaiheessa kehityksessä ja muistetaan sen jälkeen joka solussa. Kolme tärkeää geenituotetta välittävät tietoa tästä suhteesta monille muille geeneille, jotka spesifioivat/vaikuttavat uros/naaras piirteisiin. Geenien nimet: dsx-geeni = doublesex: jos kärpäseltä puuttuu tämä geenituote, kärpäsellä on sekä uros että naaras piirteitä. Oletuksena on, että kärpäsestä tulee uros. Tässä pathwayssa syntyy toimimattomia RNA-molekyylejä ja proteiini, joka poistaa sellaisten geenien ekspression, joka spesifioi naarasominaisuuksia/piirteitä. Naaras-pathwayssa taas syntyy proteiini, joka poistaa sellaisten geenien ekspression, joka spesifioi urosominaisuuksia.

20 Uros-pathway: Sxl- ja tra-geenit molemmat muutetaan pre-mRNA:ksi, mutta RNA:t silmukoidaan perustavasti tuottamaan vain toimimattomia RNA-molekyylejä. dsx-RNA silmukoidaan tuottamaan proteiinia, joka vaimentaa geenit, jotka spesifioi naaraspiirteitä/ominaisuuksia. Naaras-pathway: Aktivoidaan Sxl-geenin promoottori, joka aiheuttaa Sxl-RNA:iden erityisen luokan synteesin, jotka silmukoidaan perustavasti siten että saadaan toimiva Sxl-proteiini. Sxl on silmukointia säätelevä proteiini, joka vaikuttaa kahteen kohtaan: (1) se sitoutuu perustavasti tuotettuun Sxl-RNA:han aiheuttaen naaraalle omianista silmukointia (eli syntyy toimivaa Sxl-proteiinia), joka jatkaa toiminnallisen Sxl-proteiinin tuotantoa (2) se sitoutuu perustavasti tuotettuun tra-RNA:han ja aiheuttaa tämän vaihtoehtoista silmukointia, joka tuottaa aktiivista Tra-säätelyproteiinia. Tra-proteiini vaikuttaa perustavasti tuotetun Tra-2 proteiinin kanssa, joka tuottaa dsx-RNA:n naarasspesifisen silmukointituotteen, joka koodaa Dsx-proteiinia, joka vaimentaa geenit, jotka spesifioi urospiirteitä.

21 Banaanikärpäsen sukupuolen määritys (2)
Sxl säätelee negatiivisesti Tra säätelee positiivisesti Epäselvää: ”Male-pathway”:n toimimattomat proteiinit Sxl on tukahduttaja/estäjä, joka vaikuttaa negatiivisesti ja blokkaa silmukontikohdan. Sxl sitoutuu pyrimidiinirikkaaseen nukleotidisekvenssiin, joka on osa standardia silmukointisekvenssiä ja blokkaa normaalin silmukointitekijän, U2AF:n pääsyn. Tra-proteiinit ovat aktivaattoreita, jotka vaikuttavat positiivisesti ja aikaansaavat silmukointia. Tra sitoutuu spesifisiin RNA-sekvensseihin eksonissa ja aktivoi puolioptimaalisia silmukointisignaaleja. Male-pathwayssä vaaditaan toimimattomien RNA-molekyylien jatkuvaa tuottoa, joka vaikuttaa tarpeettomalta tuhlaukselta. Spekulaatio: RNA-silmukointi hyödyntää vanhaa kontrollilaitetta (aikaisessa vaiheessa evoluutiota, kun RNA oli vallitseva biologinen molekyyli ja geeniekspression kontrollit perustuivat melkein kokonaan RNA-RNA-vuorovaikutuksiin)

22 Tietokantoja joista etsiä AS-sekvenssejä
ASDB: tietokanta josta voi hakea Genbank ja SWISS-PROT notaatiolla, vaikuttaa vanhentuneelta HASDB: Palauttaa tulokset tekstimuodossa ASD project: palauttaa haetusta geenistä graafisen esityksen vaihtoehtoisista silmukoinneista sekä linkit kaikkeen tarpeelliseen. ASHESdb: Palauttaa Genbank-linkit AS:istä Haku-java servelttiä ei löytynyt sivuilta testaushetkellä, ei kovin viimeistelty vaikutelma Antaa nättejä kuvia ja helppokäyttöisin esimerkeistä Ei tarkempaa tietoa oikeasta sisällöstä. Eliö geenejä variantteja ASHESdb: Ihminen Hiiri ASDB: Kaikki klusteria (eli 366 ryhmää joissa on proteiineja joilla on vähintään 20 pitkä yhteinen ah-pätkä) AsMamDB Cluster DNA mRNA CDS EST Medline Genbank Homo sapiens >100000 Mus musculus >28000 Rattus norvegicus >2400

23 Lisätietoa B. Modrek, A. Resch, C. Grasso, C. Lee (2001) Genome-wide detection of alternative splicing in expressed sequences of human genes. Nucleic Acid Research, 2001, Vol. 29, B. Modrek, C. Lee, (2002) A genomic view of alternative splicing. Nature genetics, Vol. 30, 13-19 G. C. Roberts, C. W. J. Smith, (2002) Alternative splicing: combinatorial output from the genome. Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 6,