Solujen pakastus (varastointi) Osa soluista varastoidaan tulevaa käyttöä varten Rajallinen kasvupituus  täytyy säilöä Soluterapiassa varastoidaan valmiiksi karakterisoitu linja (master cell bank), josta sulatellaan eriä hoitokäyttöön Estetään muutoksia genotyypissä ja transformaatiota Säilötään ennen senescenssiä, ”nuoria” soluja käyttöön Estetään muutoksia solun toiminnassa Pakastetaan nestetyppeen -196oC DMSO:ta, seerumia ja mediumia DMSO = cryoprotectant  estää jään muodostumista solun sisälle Sulatetaan ampullit nopeasti ja laitetaan kasvatusalustalle

Kontaminaatiot Solujen hyvät kasvatusolosuhteet otollisia myös mikro-organismeille Bakteerit Hiivat Sienet Mykoplasma (pahin kontaminoija, koska vaikea havaita ja päästä eroon) Voidaan välttää steriilillä työskentelyllä ja lisätyillä antibiooteilla Soluterapiatuotteissa myös eläinperäiset materiaalit (xenogeneous) Eläinperäinen seerumi (fetal calf/fetal bovine) Feeder solut, esim hiiren endoteelisolut Kasvutekijöiden tai vasta-aineiden valmistuksessa siirtyneet eläinperäiset proteiinit (Neu5Gc)  riski immunivasteen syntymiselle.

Soluterapiatuotteiden kasvatus (GMP) GXP järjestelmät GMP = Good Manufacturing Practice GLP = Good Laboratory Practice Viitataan lääketuotannossa edellytettyihin formaalisiin laatujärjestelmiin, joiden soveltamisala ja sisältö on määritetty lainsäädännössä

Soluterapiatuotteiden kasvatus (GMP) Esimerkkejä GXP-järjestelmien edellyttämistä osa-alueista Organisaatiokaavion ja vastuun määrittäminen Tarkat toimintaohjeet työvaiheille Laadunvalvontaan liittyvät testit ja analyysit Materiaali, tuote, tuotantoympäristö Toimintojen dokumetointi Täydellinen jäljitettävyys Toiminnot, lähtömateriaali, työntekijät jne.

Kantasolujen kasvatus erilaisiin soluterapiatarpeisiin Alkion kantasolut Sydäninfarkti Sydänlihassolujen erilaistus ja karakterisointi Aikuisen kantasolut Mesenkymaaliset kantasolut Luuvaurion korjaus Osteoblastien erilaistus ja karakterisointi

Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa Sydäninfarkti aiheuttaa yleensä laaja-alaisen sydänlihassolujen tuhon ja tilalle muodostuu sykkimätön arpikudos  sydämen toiminta heikkenee Aikuisen sydänlihassolujen uusiutumiskyky on erittäin huono  kantasoluterapia Alkion kantasoluista sydänlihassoluja  toiminta paranee hMSCs ja immunomodulaatio  ei synny yhtä isoa arpikudosta  toiminta paranee

Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa END-2 menetelmä: END-2 solujen (visceral endodermal cells) maljaus gelatiini päällystetylle kuoppalevylle Erilaistumattomien ihmisen alkionkantasolujen leikkaaminen END-2 solujen päälle. EB (embryoid body)-menetelmä: Erilaistumattomien hESC leikkaaminen suspensioon 20 % FBS medium koko kasvatuksen ajan EB:ien kasvatus 4-10 päivää suspensiossa  maljaus gelatiini päällystetylle kuoppalevylle.

Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa Hiiren endodermaalisten solujen (END-2) maljaus gelatiini-päällystetylle pinnalle Erilaistumattomien alkion kantasolukolonioiden mekaaninen leikkaaminen Palat suspensioon jossa mukana 20% FBS  Embryoid Body Palat END-2 solujen päälle, ilman seerumia. Kasvatus 4-10 päivää suspensiossa Maljaus gelatiini-päälystetylle maljalle Kasvatus 9-20 päivää Sykkivien alueiden havainnointi Sykkivien alueiden havainnointi

Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa Lääkeainekokeilut: - Ylärivillä perustaso - 0.017 mg/ml isoprenalin - 14.3 mg/ml esmolol - 25 mg/ml esmolol Johtavuus: - sykintä alkaa elektrodista a - etenee b:n kautta c ja d d a c

Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa: Yhteenveto Erilaistumistehokkuudet yleisesti ottaen matalia Suuri vaihtelevuus eri kertojen välillä Karakterisoinnit Sydänlihassolun kaltaisia Troponin T sarkomeerirakenne Cd-43, Nkx2.5, Elektrofysiologiset ominaisuudet vastaavien fysiologisten sydänlihassolujen kanssa Erilaistettuja soluja voitaisiin käyttää tulevaisuudessa esim. soluterapian kehittämsessä ja lääkeaine/toksikologia testauksissa Varsinaisiin soluterapiahoitoihin riittävän solumäärän saavuttaminen vaikeaa Lisäksi pitäisi saada puhdas sydänlihassoluviljelmä Eroon erilaistumattomista hESCs  teratoma

Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Mesenkymaaliset kantasolut erilaistuvat in vitro osteoblasteiksi Dexamethasone, b-glycerophosphate, ascorbic acid 2-5 viikkoa Ilmenee morphologian muutoksina, ALP aktiivisuuden nousuna, kalsiumin mineralisaationa, kollageeni tyypin I expressiona ym. Sovellutuksia suurten luuvaurioiden hoidoissa joko erilaistumattomina tai in vitro erilaistettuina yhdessä Scaffoldien ja kasvutekijöiden kanssa

Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Potilaan luuydinnäyte Ficoll eristys  mononukleaariset solut Solujen maljaus muovialustalle Kasvatetaan solumäärää muutaman passagen verran Erilaistumattomat kantasolut Dexamethasone, b-glycerophosphate, ascorbic acid 3-5 vkoa Erilaistuneet osteoblastit - ALP aktiivisuus - mineralisaatio - tyypin 1 kollageeni

Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa 3 viikon erilaistumisjakso  ALP aktiivisuuden määritys

Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Genomisen DNA:n metylaatioasteen muuttuminen 3 viikon erilaistumisjakson jälkeen

Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Mesenkymaalisten kantasolujen luuerilaistaminen in vitro on jo rutiininomaista Pystytään tuottaan merkittäviä määriä osteoblasteja Vrt. Sydänerilaistumisen tehokkuuteen Erilaistettuja soluja käytetty kliinisissä kokeissa