Valomikroskopian alkeet Mikael Niku ELTDK / PELL / Anatomia, 2001 Histologisten tekniikoiden alkeet
Mikroskopiaa jo 1600-luvulta Kuvat: Molecular Expression Microscopy Primer (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/) Histologisten tekniikoiden alkeet
Valomikroskoopin osat Kurssilla käytettävä Olympus CH2-mikroskooppi Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Valonlähde Yleensä volframihalogeenilamppu Kirkkaus säädettävissä jännitettä muuttamalla Huomaa, että valon väri muuttuu samalla! Tämä on muistettava varsinkin valokuvattaessa. Lamppuun ei saa koskea paljain sormin! Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Kenttähimmennin Säätelee kondensoriin pääsevän valopylvään leveyttä Vähentää heijastuksia ja sirontaa CH2:ssa säädettävä himmennin lisä-varusteena (kiinnitys nuolen osoittamaan kohtaan) Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Kondensori Keskittää valon tasaisesti näytteeseen Säädöt vaikuttavat ratkaisevasti kuvan laatuun: korkeus ja apertuurihimmentimen asento Histologisten tekniikoiden alkeet
Kondensorin apertuurihimmentimen vaikutus Himmen-timen asento Erotus-kyky Kontrasti Fokus-syvyys Valoisuus AUKI hyvä huono lyhyt kirkas KIINNI pitkä tumma Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Ristisiirtopöytä Tähän pannaan näyte Liikuttelu tarkasti X- ja Y-suunnassa Asteikkojen avulla voidaan merkitä muistiin kiinnostavan kohteen sijainti Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Objektiivit Valomikroskoopin tärkein (ja kallein!) osa Mitä enemmän erilaisten taittovirheiden korjausta, sitä parempi kuva (ja kalliimpi hinta) Akromaattiset halvimpia ja tavallisimpia, apokromaattiset kalleimpia; tasokorjatuissa (plan) kuva kaartuu vähemmän Kiinnitys revolveriin kierteellä Histologisten tekniikoiden alkeet
Objektiivien merkinnät Histologisten tekniikoiden alkeet
Objektiivien merkinnät: numeerinen apertuuri Numeerinen apertuuri (N.A.): mitä suurempi, sitä kirkkaamman kuvan objektiivi tuottaa ja sitä pienemmät yksityiskohdat erottuvat – toisaalta syvyysterävyys pienenee Ilman immersioaineita käytettävissä objektiiveissa N.A. korkeintaan 0,95; öljyimmersiolla jopa 1,4. Siksi yli 40X suurentavat objektiivit yleensä öljy-immersio-objektiiveja. Histologisten tekniikoiden alkeet
Objektiivien merkinnät: tubuspituus Kertoo, millaista mikroskoopin tubuspituutta (mitta objektiivin kiinnityskohdasta okulaarin kiinnityskohtaan) varten objektiivi on optimoitu Vanhemmissa objektiiveissa yleensä 160 tai 170 mm, uudemmissa ääretön Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Öljyimmersio Öljyn taitekerroin vastaa peitinlasin taitekerrointa, joten valo ei taitu rajapinnassa objektiivin numeerinen apertuuri saadaan suuremmaksi Voidaan käyttää vain erityisillä immersio-objektiiveilla! Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Okulaarit Suurentavat objektiivin kuvaa vielä lisää Okulaarin suurennoksen ei kannata kuitenkaan olla rajattoman suuri: kokonais- suurennos (objektiivin suurennos x okulaarin suurennos) 500-1000 x objektiivin N.A.; yleensä 4-25X Mieluummin 40X objektiivi ja 10X okulaari kuin toisin päin, jotta saadaan suurempi N.A. käyttöön Kiinnitetään tubuksen helakkeeseen yksinkertaisesti työntämällä Histologisten tekniikoiden alkeet
Mikroskoopin käsittely Ole varovainen, äläkä hosu! Mikroskopoi tukevalla alustalla poissa kirkkaasta valosta ja pölystä. Pidä lasipinnat puhtaina – ole erityisen huolellinen immersioöljyn kanssa! Kun lopetat käytön, peitä mikroskooppi hupulla. Varo, ettei kuuma lamppu-kammio sulata huppua! Älä auo mikroskooppia itse äläkä irrottele objektiiveja… ne nimittäin tipahtavat helposti! Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Mikroskoopin käyttö Sytytä valo. Aloita pienimmällä objektiivilla: näyte löytyy helpommin, ja vältyt kolauttamasta objektiivia näytteeseen! Aseta näyte ristisiirtopöydälle. Tarkenna pienellä objektiivilla ja karkeasäädöllä. Säädä ensin sivusta katsoen lähelle näytettä. Katso sitten okulaariin ja tarkenna poispäin näytteestä. Säädä silmäväli ja diopterisäätö. Valitse sopiva objektiivi. Säädä valon voimakkuus sopivaksi. Tarkenna hienosäädöllä. Säädä apertuurihimmennin. Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Katsele oikein! Käytä molempia silmiä! Säädä okulaarit ja tubus itsellesi sopiviksi. Tarkenna niin, että silmät saavat olla leppoisasti lepotilassa. Tottumattomalle saattaa alkuun tulla ankarasta mikroskopoinnista huono olo, vaikka säädöt olisivatkin kunnossa… Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Tarkennus Yleensä nostamalla ja laskemalla ristisiirto- pöytää Aloita pienellä objek- tiivilla, jotta et kolauta etulinssiä preparaattiin! Ole varovainen erityisesti paljon suurentavien objektiivien kanssa. Huomaa CH2:ssa karkeasäädön rajoitinvipu! Histologisten tekniikoiden alkeet
Okulaarien ja tubuksen säädöt Tubuksen silmävälin säätö: Tarkenna preparaattiin 10X objektiivilla. Säädä silmäväli niin, että molempien silmien näkökentät yhtyvät. Näkövirheen korjaus: Peitä vasen okulaari vaikkapa paperilla. Tarkenna kuva oikealle silmälle. Peitä vuorostaan oikea okulaari. Tarkenna kuva okulaarihelaketta säätämällä. Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Köhleröinti Valaisujärjestelmän ihanteellinen säätö, joka tuottaa parhaan mahdollisen kuvan Valonlähteen kuva fokusoidaan kondensorin apertuurihimmentimeen valonsäteet kohdistuvat näytteeseen rinnakkain ja tarkentumatta siihen tasainen valaisu Säädettävä aina objektiivia vaihdettaessa, tärkeää varsinkin valokuvauksessa! Histologisten tekniikoiden alkeet
Köhleröinnin suoritus - 1 Aseta näyte mikroskooppiin ja tarkenna. Sulje kenttä-himmennintä, kunnes sen reunat näkyvät kuvassa (yleensä tässä vaiheessa sumeina – ks. kuva!) Histologisten tekniikoiden alkeet
Köhleröinnin suoritus - 2 Tarkenna kenttähimmentimen kuva kondensoria nostamalla tai laskemalla. Siirrä kuva keskelle näkökenttää vääntämällä kondensorin keskitys-ruuveja (kuva!). Histologisten tekniikoiden alkeet
Köhleröinnin suoritus - 3 Avaa kenttähimmennintä, kunnes n. ¾ näkökentästä näkyy. Tarkenna uudestaan. Histologisten tekniikoiden alkeet
Köhleröinnin suoritus - 4 Avaa kenttähimmennintä sen verran, että koko kuva-ala valaistuu juuri ja juuri. Älä avaa yhtään enempää – se vain aiheuttaa heijastuksia ja huonontaa kontrastia. Histologisten tekniikoiden alkeet
Köhleröinnin suoritus - 5 Säädä apertuurihimmennin: Jos kondensorissa on asteikko, säädä arvoksi 70-80% objektiivin N.A.:sta. Jos ei ole, poista toinen okulaari helakkeesta ja kurkista sisään. Sulje himmennintä, kunnes näet valoisana 70-80% näkökentästä. Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Öljyimmersion käyttö Etsi näytteestä haluttu kohta ja tarkenna 10X tai 40X objektiivilla. Käännä immersio-objektiivi siten, että saat tipan öljyä sen etulinssiin. Laita tippa myös preparaatin päälle. Käännä objektiivi kohdalleen. Öljyn pitäisi täyttää etulinssin ja peitinlasin väli. Varo, ettei linssi kolahda näytteeseen! Tarkenna hienosäädöllä. Jos öljyyn jää ilmakuplia, kääntele objektiivirevolveria varovasti. Öljyn kanssa on oltava tarkkana! Älä sotke muita objektiiveja siihen. Poista öljy huolellisesti käytön jälkeen – sitä ei ikinä saa jättää kuivumaan mikroskooppiin! Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Mikroskoopin hoito Pidä kaikki lasipinnat puhtaina. Puhdistus: Puhalla puhaltimella irtoroskat pois Pyyhi optiikka puhdistusnesteeseen kostutetulla vanupuikolla pyöritellen Kuivaa heti vanupuikolla tai linssipaperilla Missä lika on? Kökön sijainti selviää yleensä liikuttelemalla okulaaria, objektiiveja, kondensoria… Histologisten tekniikoiden alkeet
Histologisten tekniikoiden alkeet Lisää tietoa Valtavan hieno pläjäys mikroskopiasta verkossa (mm. havainnollisia Java-interaktioita): http://micro.magnet.fsu.edu/primer/ Histologisten tekniikoiden alkeet