Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle käyttäen terbium(III)-kelaattia donorina Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Nuoret tutkijat 2008 / Arcanum

Johdanto Työn tarkoitus PSA FRET Määrityksen periaate

Työn tarkoitus Tarkoitus on kehittää homogeeninen, multiparametrinen immunomääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle –Hyödynnetään homogeenisille määrityksille hyvin soveltuvaa fluoresenssiresonanssienergiansiirtoa (FRET) –Määrityksessä käytetään vasta-aineita, jotka tunnistavat joko vapaan ja/tai kompleksoituneen PSA:n

PSA Prostata-spesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja PSA:ta esiintyy verenkierrossa –vapaana –kompleksoituneena (yleensä α1-antikymotrypsiinin kanssa)

PSA Seerumin korkea kokonais-PSA -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta PSA:ta käytetään tässä työssä mallianalyyttina –kaksi eri muotoa – soveltuu hyvin multiparametriseen määritykseen

FRET FRET vaatii lähekkäin (<10 nm) olevan luovuttaja- ja vastaanottajavärin, joiden emissio- ja viritysspektrit ovat osittain päällekkäin FRET-parin viritysaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat kaukana toisistaan, joten määrityksen epäspesifinen tausta jää matalaksi Mittausaallonpituudet valittiin siten, että Tb(III)- kelaatin emissio olisi mahdollisimman matala

Määrityksen periaate

Spektrit

Materiaalit ja menetelmät Käytetyt vasta-aineet Leimaukset Määritykset

Käytetyt vasta-aineet Kaikki monoklonaalisia 5E4 –Sitoutuu vapaaseen ja kompleksoituneeseen PSA:han H50 –Sitoutuu vapaaseen ja kompleksoituneeseen PSA:han 5A10 –Sitoutuu vain vapaaseen PSA:han

Leimaukset Luovuttaja 5E4 Mab leimattiin terbium(III)-kelaatilla Vastaanottaja H50 ja 5A10 Mabit leimattiin Alexa Fluor 680:lla Myöhemmin H50 leimattiin myös Alexa Fluor 488:lla

Määritykset Varsinaiset mittaukset –BSA-pinnoitetuissa kaivoissa 100 µl tilavuudessa 50 ng kutakin vasta-ainetta –2 x 45 min / 1 x 1h inkubointi huoneen lämmössä –Mittaukset tehtiin Victor 1240 monileimalaskimella (Perkin Elmer MA, USA), johon oli lisätty punaherkkä valomonistinputki (Hamamatsu PMT R4632).

Tulokset Leima-asteet Standardisuora Kinetiikkatarkastelu Multiparametrimääritys

Leima-asteet Tb – 5E4 Mab (luovuttaja) –leima-aste 12,4 AF 680 – 5A10 Mab (vastaanottaja) –leima-aste 4,6 AF 680 – H50 Mab (vastaanottaja) –leima-aste 5,4 AF 488 – H50 Mab (vastaanottaja) –leima-aste 5

Standardisuora AF 680 leimatut 5A10 ja H50 vastaanottaja- Mabit Signaalin määrä kasvaa PSA- pitoisuuden noustessa y = 601,15x 0,8378 R 2 = 0,9976 y = 266,89x 0,8662 R 2 = 0,998

Kinetiikka Kahden tunnin inkubointi ei muuta signaalin määrää

Multiparametrinen määritys

Päätelmät Työssä on todistettu fluoresenssiresonanssienergiansiirron toimivan määrityksessä vapaalla PSA:lla –Vastaanottajavärin signaali kasvaa kummankin vasta- aineen kohdalla PSA:n määrän noustessa Energiaa siirtyy myös, kun molemmat leimatut vasta-aineet ovat läsnä  Mittaukset voidaan tehdä multiparametrisesti

Alun perin määritys oli tarkoitus pystyttää käyttämällä Fabeja Mab Fab

Jatkossa Optimoidaan vasta-aineiden määriä Optimoidaan kinetiikkaa Potilaspaneeli, jos aikaa jää

Kiitokset Ohjaajat Ulla ja Tiina Erikoistyöntekijät ja muu biotekniikan väki Turun Yliopiston Kemistit TYK ry:n aktiivit