Seppo Saarela (eläintieteen osuus) http://cc.oulu.fi/~ssaarela/sb.htm Solubiologia 750121 (5 op) Seppo Saarela (eläintieteen osuus) http://cc.oulu.fi/~ssaarela/sb.htm

Tentit ja muut suoritukset Kotitentti: solun kemia, solubiologiset tutkimusmenetelmät, solubiologian historia (esseevastausten palautus vko 41 perjantai 07.10.2011 klo 16 mennessä) Tentit (eläintieteen osuus): 1 vk. torstai 20.10. klo 10-12 salissa L4, uusinta perjantai 04.11. klo 14-16 salissa YB210

Mistä löytyy tietoa? Oppikirja: Molecular Biology of the Cell: Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts & Waalter. Garland 2008 http://www.garlandscience.com/textbooks/0815332181.asp Molecular Cell Biology (6. painos) 2008 Lodish, Berk, Zipursky, Matsudaira, Baltimore & Darnell. Freeman Solubiologia (2. painos) 2004, Jyrki Heino & Matti Vuento. WSOY

Mistä löytyy … Tieteelliset lehdet: Cell, Nature, Science http//:cc.oulu.fi/~ssaarela/

Kemian perustiedot oletetaan Kemialliset reaktiot Lähtötaso-oletus Kemian perustiedot oletetaan hankituiksi jo aiemmin Kemialliset reaktiot Solubiologian kannalta tärkeät yhdisteet

Plasma membrane Peroxisome Mitochondrion Nucleus Nucleolus Rough ER Smooth ER Golgi apparatus Nuclear pore Lysosome Cytoskeletal fibers

Kantasolukeksintö mahdollistaa henkilökohtaiset soluvaraosat Kari Alitalo & Timo Otonkoski Helsingin Sanomat 20.9.2008

Sisältö 1 Solubiologian opiskelusta Käytännön ohjeita solubiologian opiskeluun Solubiologian historia Solubiologian kannalta tärkeitä tiedemiehiä ja keksintöjä. Nämä asiat kuuluvat "hauska tietää" -kategoriaan.

Sisältö 2 Solubiologiset tutkimusmenetelmät Solun kemia Solun rakenteen ja toiminnan kannalta tärkeät pienmolekyylit, makromolekyylit, epäorgaaniset ja orgaaniset yhdisteet. KOTITENTTI TÄHÄN SAAKKA!

Sisältö 3 Solun rakenne ja toiminta SOLUKALVO Solukalvon kemiallinen koostumus ja hienorakenne Aineiden kulkeutuminen solukalvon läpi Solukalvojen erilaistumat ja solujen kiinnittyminen toisiinsa

Sisältö 4 Endosytoosi Eksosytoosi Sytosoli ja solunsisäinen kalvosto Tärkeimpiä käsiteltäviä organelleja eläintieteen osuudessa ovat: Endoplasmakalvosto Golgin laite

Sisältö 5 Lysosomit Peroksisomit Glyoksisomien rakenne ja toiminta opiskellaan kasvitieteen osuudessa. Kalvostojen liike

Sisältö 6 Ribosomit ja valkuaisainesynteesi Energian virtaus ja energia-aineenvaihdunta soluissa Mitokondriot Energia-aineenvaihdunta

Sisältö 7 Anaerobinen ja aerobinen soluhengitys Fototrooppinen energia-aineenvaihdunta käsitellään kasvitieteen osuudessa Solun tukiranka Tuma Ainoastaan tuman rakenne käsitellään tässä yhteydessä. Tuman merkitys solun toiminnan kannalta ja perinnöllisen informaation siirrossa käsitellään perinnöllisyystieteen osuudessa.

Sisältö 8 Erilaistuneita soluja 1. Lihassolu 2. Hermosolu Signaalien välitysmekanismit 1. Sähköinen signaalinvälitys 2. Hormonit ja reseptorit Solujen erilaistuminen ja solukuolema

Mikä virhe pakinassa? Miksi Jeppe juo? Kuopiolaiset ovat löytäneet viinageenin! Ihmiset, joilta puuttuu geeneistään ihastuttava valkuaisaine nimeltään neuropeptidi Y, sortuvat jupotteluun. Sanomalehti Kaleva kesä 2000

Solujen vanheneminen Scientific American 1997 Terveessä mitokondriossa happi sitoutuu oksidatiiviseen fosforylaatioon Vanhenemisen myötä ATP:tä syntyy vähemmän ja vapaiden radikaalien osuus lisääntyy. Scientific American 1997

Mitä kuva mahtaa esittää? Mihin solurakenteisiin vapaat radikaalit “iskevät”? Scientific American 1997

Kysymyksiä Mistä solut tulevat? Miten organismit muodostavat sidoksia? Miten tulehtunut kudos nopeasti täyttyy valkosoluilla? Solujen alkuperän ymmärtäminen on tärkeää biologiassa ja lääketieteessä!

Mistä solut tulevat? Rudolf Virchow - lääkäri ja antropologi osoitti 1850-luvulla, että solut muodostu-vat aina toisista soluista

Solut eivät peräisin nonsellulaarisesta materiaalista! Syöpäkudoksen nopea kasvu johtuu orga-nismin omien solujen kontrolloimattomas-ta jakautumisesta. Valkosolujen nopea kasautuminen tulehtuneeseen kudokseen on peräisin verenkierrosta.

Elävät organismit Saavat energiaa ympäristöstä Suorittavat kemiallisia reaktioita Muuttuvat ajan mukana Reagoivat ympäristöön Lisääntyvät

Voidaanko solu määritellä? Solu on kaikkien organismien pienin toiminnallinen yksikkö. Molekulaarisella tasolla kaikki solut muistuttavat toisiaan. Moderni solubiologia pyrkii selittämään ja etsimään ominaisuuksia soluorganellien ja pienempien solurakenteiden tasolla.

Solubiologian juuret

Historia 1 Soluoppi eli sytologia (kreik. kytos = kotelo) Robert Hooke (1665): cellula (= solu, suom. Lönnrot) 1674 van Leeuwenhoek - kuvasi useita solutyyppejä

Historia 2 1800-luku Schleiden ja Schwann (1838): “Kaikki eläimet ja kasvit rakentuvat soluista” Hertwig: Uusi yksilö syntyy kahden solun yhteensulautumisesta Mendel (1865)

Historia 3 1900-luku Sumner (1926): Entsyymit ovat valku-aisaineita Beadle ja Tatum (1940): Mutaatiokäsite Averly (1944): DNA sisältää geneettisen informaation Watson ja Crick (1953): DNA:n rakenne kaksoishelix

Historia 4 1950-luku elektronimikroskopia kehittyi (tosin keksittiin jo 1931)  soluorganellit (Palade, Claude, de Duve 1974) 1980-luku yhdistelmä-DNA, DNA:n emäsjärjestys (Berg, Gilbert, Sauger)

Historia 5 Konfokaali- ja scanning-elektronimikroskooppi yleiseen käyttöön 1990-luku videotekniikka mikroskopoinnissa (Allen ja Inoue) transgeenisten eläinten tuottaminen Immunoblottaus, Northern, Western PCR, q-PCR (RT-PCR) 2000-luku geenisiru Genomiikka Transkriptomiikka Proteomiikka Fysiomiikka

Solubiologisia tutkimusmenetelmiä

Skaalaus 10m 1m Mikroaallot (radio- 0.1 m aallot) 1 cm 1 mm Ihmisen pituus 1m Eräiden hermo ja lihassolujen pituus Mikroaallot (radio- aallot) 0.1 m Kananmuna 1 cm Sammakon muna 1 mm Infrapuna (IR) 100 μm Kasvi- ja eläinsolut Näkyvä valo 10 μm Tuma, bakteerit, mitokondrio 1 μm UV-valo 100 nm Mykoplasma, virukset 10 nm Röntgensäteet Ribosomit, pallomaiset proteiinit, lipidit 1 nm Pienet molekyylit -säteet

Mikroskoopit Suurennus ja erotuskyky valomikroskooppi max 1000 x elektronimikroskooppi jopa 10 000 x tärkeämpi on resoluutio eli erotuskyky

Valomikroskoopin periaate Hooke, van Leeuwenhoek 1600-luku objektiivi yl. 10-100 x okulaari 4-16 x kondensori kohdistaa valon, useita osalinssejä suurennus = obj x okul.

Valomikroskooppi

Resoluutio eli erotuskyky Resoluutio paranee, kun aallonpituus lyhenee tai objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa

Resoluutio 2 Objektiivin numeerinen apertuuri kasvaa, kun objektiivin avautumiskulma kasvaa Objektiiveja, joiden NA jopa 0.95

Resoluutio 3 Immersioöljyä (taitekerroin sama kuin objektiivilla) käyttämällä objektiivin ja kohteen välissä taitekerroin paranee. NA voi olla jopa 1.4 Näin mikroskoopin erotuskyvyn max  1/3 käytetyn valon aallonpituudesta r  0.2 m  mitokondriot voi erottaa pistemäisinä

Resoluutio 4 Elektronivuon aallonpituus  10 pm  erinomainen erotuskyky

Fluoresenssimikroskooppi Valonsäde valolähteestä kulkee ekskitaatiosuotimen kautta (musta viiva) Näytteen valaiseminen tämän valonsäteen avulla saa aikaan molekyylien fluoresenssin (elektronien virittyminen), emittoituu ja lähettää valoa pitemmällä aallonpituudella (sininen)

Fluoresenssimikroskooppi Näytteeseen kohdistetaan UV-valoa (360-400 nm) objektiivin jälkeen UV leikataan pois suotimella  fluorisoiva aine näkyy vihreänä (fluorisoivat värit)

Fluoresenssimikroskopia 1 Fluoresenssimikro-graafi osoittaa pitkien aktiinisyiden jakautumisen fibroblastisoluviljel-mässä Ihmisen ihon fibroblasteja käsiteltiin ensin detergentillä ja sitten värjättiin antiaktiini antibodylla

Fluoresenssimikroskopia 2 Hiiren lisäkives: suurennus 1.25x40 (Ahti Pyörnilä)

Fluoresenssimikroskopia 3 Metsäsopuli (Myopus schisticolor), ruskea rasvakudos (BAT), suurennus 10x100x1.25 (Ahti Pyörnilä ja Seppo Saarela)

Fluoresenssimikroskopia 4 Osoittaa sympaattisten hermopäätteiden (noradren-ergisten) esiintymisen Helmipöllön sydän: Noradrenaliinin fluoresenssi, 10x40x1.25 (Ahti Pyörnilä)

Fluoresenssimikroskopia 5 Heat shock proteiinin ekspressoituminen C. elegans mutantissa. Fluoresenssiajastin Proteiini, joka vaihtaa väriä ajan funktiona Terskikh et al. (2000) Science 24 Nov

Pimeäkenttämikroskooppi Vain kohteen rajapinnoista siroava valo päästetään ohjektiiviin Tumma tausta  voidaan erottaa pienempiä kohteita

Faasikontrastimikroskooppi Vaihevastakohta-mikroskooppi Näytteen läpi kulkeneeseen valoon aiheutetaan 1/4- aallon vaihe-ero  yhdistetään sironneeseen valoon  vaihe-erot muuttuvat amplitudieroiksi kontrasti kuvan osien välille

Faasikontrastimikroskooppi Optiikka Suora valo mustalla Näytteestä lähtenyt hajavalo punaisella

Interferenssimikroskooppi Kaksi sädettä: näytteeseen ja näytteestä ohi Säteiden yhdistäminen  vaihe-ero  amplitudiero Muistuttaa faasikontrastia, mutta antaa 3D-vaikutelman

Mikrograafeja Fibroblasti kudosviljelmässä: Valomikroskopia ilman värjäystä Faasikontrastimikroskopia Interferenssikontrasti-mikroskopia Pimeäkenttämikroskopia

KONFOKAALIMIKROSKOPIA Konfokaalimikroskoopilla saadaan laservalo keskitetyksi hyvin tarkkaan yhdelle optiselle tasolle, jolloin sen pyyhkäisy antaa kuvan kyseisestä solutasosta. Ottamalla kuvia peräkkäisistä leiketasoista voidaan tiettyjen matemaattisten algoritmien avulla suodattaa kuvista pois kuvia vääristävä informaatio. Näin optimoitujen tasokuvien avulla voidaan seuraavaksi tehdä kohteesta kolmi-ulotteinen mallinnos, jota voidaan vapaasti pyörittää kaikissa suunnissa.

Biologian laitoksen konfokaalimikroskooppi Zeiss LSM5 Pascal Katja Anttila, 2004 Photo: Joose Kankare

Vesikanava Rotan jalkapohjan poikkijuovainen lihassolu Mika Kaakinen, 2004

Vesikanava kaksoisvärjäyksellä näkyy vihreänä Z-levyn prot. näkyy punaisena Mika Kaakinen, 2004

Elektronimikroskooppi Valolähteenä elektronisuihku (katodisädeputki), jännite 1-100 kV  vaikuttaa aallonpituuteen ja erotuskykyyn Linsseinä magneetit Kuva syntyy fluorisoivalle kalvolle (vrt. TV) TEM eli transmissio-EM, läpivalaisuelektronimikroskooppi - leikkeet - elektronien absorptio

Pyyhkäisy-EM (SEM) Scanning-EM Soveltuu pintojen kuvaamiseen Ei linssejä Kuva muodostuu piste pisteeltä suihkun pyyhkiesssä (“scanning”) näytteen pintaa Syntyy sekundaarielektroneja

Scanning electron microscope Pyyhkäisyeletronimikros-kooppi Kuva syntyy sekundaari-elektronien avulla, jotka emittoituvat näytteeseen Vahvistetaan tuikekiteen ja vahvistimen avulla  monitorille Näytteen pinta päällys-tetään esim. kullalla

Valo- ja elektronimikroskoopin optiset järjestelmät Valomikroskooppi käyttää näkyvää valoa ja linssejä kuvanmuodostukseen Kuva silmän verkkokal-volle, filmille tai video-kuvaksi sähköiseen muotoon EM käyttää elektroni-suihkua, joka emittoituu fluorisoivalle kalvolle tai filmille

Elektronimikroskoopit (TEM, SEM) Vasemmalla TEM:n periaate ja oikealla SEM:n periaate TEM:n periaate muistuttaa valomikroskooppia SEM:ssä näytettä pommitetaan elektroneilla ja sen jälkeen mitataan niiden sirontaa näytteen pinnasta

SEM-kuva Kesykyyhkyn väive Näytettä on rutisteltu pinseteillä! Photo: Riitta Harjula

SEM-kuva Potnapekan pää Riitta Harjula

SEM-kuva Ampiaisen jalan karvoja

SEM-kuva Kirva

Paramecium eri mikroskoopeilla kuvattuna Valomikroskoopissa SEM

Paramecium Elektronimikroskoop-pikuva (TEM)

Analyyttinen-EM Alkuaineiden pitoisuudet näytteistä

High Performance Liquid Chromatography Photo: Joose Kankare

Tehokkaat sekvensointilaitteet Mahdollista saada jopa yhdessä 9 tuntia kestävässä ajossa tietomäärä, jonka kokoaminen aiemmilla järjestelmillä vei vuosia (vrt. esim. ihmisen genomiprojekti) Soveltuu laajojen näyteaineistojen käsittelyyn Auttaa esim. sellaisten diagnostisten markkeriyhdistelmien valinnassa, jotka kuvaavat hyvin varhaisia vaiheita sairauksien kehittymisessä - metabolinen oireyhtymä - sydän- ja verenkiertoelimistön sairauksien alkuvaiheet

Tehokkaat sekvensointilaitteet … Erikoistarpeita OY:ssa erilaiset näytemateriaalit, kasvi, eläin, mikrobi, humaani, solulinja, DNA, RNA, koko genomi, valitut geenialueet Roche