Promoottorien etsintä Jenni Hulkkonen

Don King

Motivaatio  uusien geenien etsinnässä  transkription aloituskohdan ja promoottorin löytäminen vaikeata  geenien säätely  ihmisellä on kaikissa soluissaan kaikki geenit, mutta vain osa geeneistä ilmentyy joissakin soluissa  jotkin geenit toiminnassa oletusarvoisesti  sairauksien tutkiminen

Prokarioottien transkription aloitus  sigma tekijä kiinnittyy RNA polymeraasiin  kompleksi löytää transkription aloituskohdan

Eukarioottien transkription aloitus  monimutkaisempi kuin prokarioottien, koska eukarioottien perimä ja systeemit monimutkaisempia  geenit pakkautuneina  tarvitsee saada aloituskohta esille ennen kuin voidaan aloittaa koodaus  eukariooteilla tiukemmin säädelty  useita säätely tekijöitä

Transcription factorit, TF  basal factors  minimi promoottori  TATAA, RNA polymeraasi II, TFIIB,…  upstream factors  vahvistajat ja hiljentäjät  variaatiot  jotkut kirjaimet voivat olla erilaisia, esimerkiksi viereinen proteiini voi antaa tämän mahdollisuuden  sensitiivisyys ja spesifisyys  voidaan kuvailla matemaattisin mallein:  matriisipohjaiset ovat spesifisempiä kuin IUPAC  painomatriisit voivat ennustaa sitoutumisaffiniteettia  matriisiperheet sisältävät TF:ien biologisen vaihtelevuuden

TFBS = transcription factor binding site  lyhyt pätkä DNA:ta (5-25nukleotidiä)  sitoutunut yksi tai useita transcription factoreita  hyvin konservoituneita  säätelykohtia:  jopa nukleotidin päässä  otettava huomioon myös toinen juoste  voi olla myös geenin sisällä

DNA:han sitoutuvat domainit  Zinc finger  Leucine Zipper  Homeodomain  tärkeitä kehitysbiologiassa  TATA- sitoutuva proteiini

CpG islands  Ihmisen genomissa CpG dinukleotidit ovat harvinaisia  CpG parit käyvät läpi metylaation, joka muuttaa C nukleotidia  Metyloitu C voi mutatoitua hyvin suurella todennäköisyydellä T:ksi  Promoottori alueet ovat CpG rikkaita  Alueita ei ole metyloitu ja täten mutatoituvat harvemmin (evolutionäärisesti tärkeitä)  Näitä kutsutaan CpG islandeiksi

Mikrosirut  Promoottorien ennustamisessa käytetään hyväksi mikrosiruja  sirujen avulla etsitään samalla tavalla ekspressoituvia geenejä  tällä hetkellä käytännössä ainoa keino etsiä uusia transcriptio factoreita

Ohjelmat  pelkästään sekvenssiin pohjautuvia  TATA box  CpG islands  tulevaisuudessa 3-uloitteisuus huomioon

Promoottori alueen etsintä  promoottori analyysi tarvitsee promoottorin sekvenssin  saaminen voi olla triviaalia!  meneekö vastavirta sekvenssi toisen promoottorin päälle?  ohjelmia:  UCSC  tarvitsee RefSeq mRNA accession koodit  tarjoaa valmiiksi tehdyn kokoelman vastavirta sekvensseistä  LocusLink  tärkeä UCSC:n käyttöön jos ei RefSeq koodeja  EnsMART

Promoottori alueiden analyysi  etsitään jo tiedossa olevia TFBS vastavirrasta  The TRANSFAC database ver. 6.0  eukarioottien transkriptio tekijöiden, niiden genomiin sitoutuvien osien ja DNA sitoutumisprofiilin tietokanta  Gene Regulation  Match  potentiaalisten transkriptio tekijöiden sitoutumiskohtien etsimiseen  käyttää TRANFAC 6.0:n kirjastoa mononukleotidi painomatriiseista

Uusien transkriptio tekijöiden etsintä  MEME  Työkalu motifien etsintään DNA:sta  Motif on pala sekvenssiä joka toistuu sukulais DNA sekvenssien ryhmässä  Kuvaa motifeja paikkariippuvaisilla kirjaintodennäköisyys matriiseilla, jotka kertovat kuinka todennäköisiä jokainen mahdollinen kirjain on kussakin kohtaa sekvenssi pätkää  Yksittäinen MEME motif ei sisällä aukkoja  Aukkoja sisältävät MEME jaetaan kahteen tai useampaan erilliseen motifiin  Antaa ulos yhtä monta motifia kuin on pyydetty  AlignACE  Käyttää Gibbs sampling algoritmiä

Genomatix  Sovelluksella kuukausittaiset rajat  Matinspector  Etsii transcriptio tekijöiden sitoutumiskohtia  Käyttää matriiseja sekä IUPAC kirjastoja  Sisältää noin 400 sitoutumiskohtaa  ElDorado  Näyttää saatavilla olevan annotaation genomi alueesta  Gene2Promoter  Etsii ja analysoi promoottoreita  Promoottoreiden suoraan hakemiseen  PromoterInspector  Promoottorien hyvin specifinen ennustaminen nisäkkäille  Promoottori alueiden etsimiseen  Suunniteltu paikantamaan potentiaalisia promoottori alueita DNAn kohdista, joita ei ole vielä annotoitu  Ihmisen korkealaatuisiin promoottoreihin käytä elDoradoa tai Gene2Promoteria

Lähteet   luentokalvoja  Molecular Biology of the Cell

Kiitoksia! Kysymyksiä?

 /nucleosomes_chromati n.jpg

es/alex/images/0905_2.gif

&imgrefurl= wn_IJ:&tbnh=57&tbnw=131&start=103&prev=/images%3Fq%3Dnucleosomes%26start%3D100%26hl%3Dfi%26lr%3D %26sa%3DN  Prokaryotic DNA  The main DNA in prokaryotes is a circular molecule attached to the plasma membrane.  Some DNA is organized in smaller circles called plasmids.  90% of the genome consists of functional genes, i.e. genes coding for proteins.  Genes coding for a metabolic pathway are lumped together into an operon.  Eukaryotic DNA:  Prokaryotic DNA is a relatively simple circular molecule. In eukaryotes, DNA is associated with proteins to form a complex called chromatin.  Chromatin  A variety of proteins form part of this complex:  Histones are small, basic, structural proteins that bind to negatively charged phosphate groups. They show a highly conserved structure (homology) between higher and lower organisms.  Nonhistones are regulatory proteins(leucine zippers; zinc fingers). 

Promoottori  Ennen geenin transkription alkamista tarvitaan useita prosesseja ennen kuin varsinainen luenta voidaan aloittaa

 Nucleosomes  DNA is tightly wrapped around a protein core made of basic protein (histones).  Each repeating unit (nucleosome) consists of 200 base pairs, which shortens the length of DNA by about 10-fold.  The space between nucleosomes is a site for binding of regulatory proteins that initiate DNA replication or transcription.  DNA appearing as a string of beads (nucleosomes) is an active form of DNA and is called euchromatin.  Coiled nucleosomes  In order to shorten DNA further (the shorter the strand the less likely it is to get entangled with other  strands), nucleosomes are supercoiled like rope.  In this form, DNA is inactive, proteins reading DNA are sterically hindered by the dense further packing of chromatin. The inactive state of DNA is referred to as heterochromatin.  Extended chromatin  That’s not enough. The “rope” of coiled nucleosomes folds over in pleats, forming an extended chromatin. The folds are held by nonhistone binding proteins.  Condensed chromatin  The folded fiber can be folded again, generating condensed chromatin.  Chromosome  Finally, condensed chromatin folds again to form a chromosome.  This most condensed form of a single DNA molecule occurs only during cell division.

Kolme perusmekanismia