Lataa esitys
Esittely latautuu. Ole hyvä ja odota
JulkaistuPäivi Majanlahti Muutettu yli 9 vuotta sitten
1
Homogeeninen multiparametrimääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle käyttäen terbium(III)-kelaattia donorina Tuomo Liljenbäck Ohjaajat: Fil.yo Ulla Karhunen ja FM Tiina Kokko MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Nuoret tutkijat 2008 / 11.3.2008 Arcanum
2
Johdanto Työn tarkoitus PSA FRET Määrityksen periaate
3
Työn tarkoitus Tarkoitus on kehittää homogeeninen, multiparametrinen immunomääritys vapaalle ja kokonais-PSA:lle –Hyödynnetään homogeenisille määrityksille hyvin soveltuvaa fluoresenssiresonanssienergiansiirtoa (FRET) –Määrityksessä käytetään vasta-aineita, jotka tunnistavat joko vapaan ja/tai kompleksoituneen PSA:n
4
PSA Prostata-spesifinen antigeeni (PSA) on paras ja käytetyin yksittäinen eturauhassyöpämerkkiaine Eturauhassyöpä on yleisin länsimaisten miesten syöpä ja toiseksi suurin syöpään liittyvien kuolemien aiheuttaja PSA:ta esiintyy verenkierrossa –vapaana –kompleksoituneena (yleensä α1-antikymotrypsiinin kanssa)
5
PSA Seerumin korkea kokonais-PSA -pitoisuus voi johtua syövän lisäksi eturauhasen hyvänlaatuisesta liikakasvusta PSA:ta käytetään tässä työssä mallianalyyttina –kaksi eri muotoa – soveltuu hyvin multiparametriseen määritykseen
6
FRET FRET vaatii lähekkäin (<10 nm) olevan luovuttaja- ja vastaanottajavärin, joiden emissio- ja viritysspektrit ovat osittain päällekkäin FRET-parin viritysaallonpituus ja emissioaallonpituus ovat kaukana toisistaan, joten määrityksen epäspesifinen tausta jää matalaksi Mittausaallonpituudet valittiin siten, että Tb(III)- kelaatin emissio olisi mahdollisimman matala
7
Määrityksen periaate
9
Spektrit
10
Materiaalit ja menetelmät Käytetyt vasta-aineet Leimaukset Määritykset
11
Käytetyt vasta-aineet Kaikki monoklonaalisia 5E4 –Sitoutuu vapaaseen ja kompleksoituneeseen PSA:han H50 –Sitoutuu vapaaseen ja kompleksoituneeseen PSA:han 5A10 –Sitoutuu vain vapaaseen PSA:han
12
Leimaukset Luovuttaja 5E4 Mab leimattiin terbium(III)-kelaatilla Vastaanottaja H50 ja 5A10 Mabit leimattiin Alexa Fluor 680:lla Myöhemmin H50 leimattiin myös Alexa Fluor 488:lla
13
Määritykset Varsinaiset mittaukset –BSA-pinnoitetuissa kaivoissa 100 µl tilavuudessa 50 ng kutakin vasta-ainetta –2 x 45 min / 1 x 1h inkubointi huoneen lämmössä –Mittaukset tehtiin Victor 1240 monileimalaskimella (Perkin Elmer MA, USA), johon oli lisätty punaherkkä valomonistinputki (Hamamatsu PMT R4632).
14
Tulokset Leima-asteet Standardisuora Kinetiikkatarkastelu Multiparametrimääritys
15
Leima-asteet Tb – 5E4 Mab (luovuttaja) –leima-aste 12,4 AF 680 – 5A10 Mab (vastaanottaja) –leima-aste 4,6 AF 680 – H50 Mab (vastaanottaja) –leima-aste 5,4 AF 488 – H50 Mab (vastaanottaja) –leima-aste 5
16
Standardisuora AF 680 leimatut 5A10 ja H50 vastaanottaja- Mabit Signaalin määrä kasvaa PSA- pitoisuuden noustessa y = 601,15x 0,8378 R 2 = 0,9976 y = 266,89x 0,8662 R 2 = 0,998
17
Kinetiikka Kahden tunnin inkubointi ei muuta signaalin määrää
18
Multiparametrinen määritys
19
Päätelmät Työssä on todistettu fluoresenssiresonanssienergiansiirron toimivan määrityksessä vapaalla PSA:lla –Vastaanottajavärin signaali kasvaa kummankin vasta- aineen kohdalla PSA:n määrän noustessa Energiaa siirtyy myös, kun molemmat leimatut vasta-aineet ovat läsnä Mittaukset voidaan tehdä multiparametrisesti
20
Alun perin määritys oli tarkoitus pystyttää käyttämällä Fabeja Mab Fab
21
Jatkossa Optimoidaan vasta-aineiden määriä Optimoidaan kinetiikkaa Potilaspaneeli, jos aikaa jää
22
Kiitokset Ohjaajat Ulla ja Tiina Erikoistyöntekijät ja muu biotekniikan väki Turun Yliopiston Kemistit TYK ry:n aktiivit
Samankaltaiset esitykset
© 2024 SlidePlayer.fi Inc.
All rights reserved.