Kantasolut ja Soluterapia

Esitys aiheesta: "Kantasolut ja Soluterapia"— Esityksen transkriptio:

1 Kantasolut ja Soluterapia
Mika Pietilä Luentosarja TKK,

2 Solutuotteiden Karakterisointi: Laatukriteerit

3 Mitä karakterisointeja vaaditaan soluterapiatuotteilta?
EU:n lainsäädäntö (EMEA) Soluterapiatuotteet lääkelainsäädännön alaisia (2001/83/EC) Vaadittavat karakterisoinnit Identity Purity Impurities Biological activity/potency Viability Tumorigenicity Ongelmana karakterisointien suoritus Suositukset/ohjeet perustuu synteettisten lääkeaineiden testaukseen Solujen elävä muoto ja kompleksisuus tuo ongelmia Monimutkaiset tuotteet: solut ja scaffold GMP taso

4 Identity Solujen fenotyyppi ja/tai genotyyppi täytyy osoittaa
Pinta-antigeenit, biokemiallinen aktiivisuus, kyky tuottaa tiettyjä biologisesti aktiivisia tai muuten mitattavia molekyylejä, morphologia etc. Ei-solumateriaali Scaffoldit, membraanit etc. Rakenne ja koostumus määritettävä

5 Purity Yleensä soluterapiatuote sisältää vain yhdentyyppisiä soluja
Halutaan päästä eroon muista solutyypeistä tai eri erilaistumisasteessa olevista soluista Täytyy pystyä osoittamaan solutuotteen puhtaus Jos sisältää muita solutyyppejä niin niiden osuus lopullisessa tuotteessa pitää pystyä osoittaan Acceptance crteria = pitää asettaa raja minkä alla olevat vierassolumäärät eivät aiheuta riskiä/heikennä tuotteen toimintaa

6 Impurities Mahdolliset mikrobiset kontaminaatiot
Tuotteeseen/prosessiin liittyvät epäpuhtaudet Esim. Eläinperäiset materiaalit Naudan Seerumi Feeder-solut Mahdolliset mikrobiset kontaminaatiot Lista testattavista mikrobeista!! Ihmiselle vaaralliset kemikaalit/reagenssit Huomioitava myös hajoamistuotteet Esim scaffolds Kaikille epäpuhtauksille asetettava hyväksymiskriteerit (acceptance criteria)

7 Viability Täytyy osoittaa kokonaissolumäärä sekä kuolleiden solujen osuus Esim. 10 milj. solua, viabiliteetti 99 % Käytettäviä menetelmiä Propidium Iodide Tryban blue Molemmat erottavat kuolleen solun elävästä perustuen solukalvon eheyteen Tarvittaisiin menetelmiä joilla pystyttyttäisiin tunnistamaan solut jotka ovat menossa kohti kuolemaa (varhainen apoptoosi) Mitokondrion toiminnan mittaaminen?

8 Potency = is the quantitative measure of biological activity based on the attribute of the product, which is linked to the relevant biological properties. The assay demonstrating the biological activity should be based on the intended biological effect which should ideally be related to the clinical response (ICH guideline 6QB).

9 Potency Voi olla joko in vitro soluviljelyyn perustuva testi tai in vivo eläinmalli Potensitestin lisäksi tärkeimpiä solun toimintoja on mitattava/seurattava tuotannnon aikana/ennen jakelua: Viability, self-renewal, apoptoosi ja erilaistuminen Vaikuttavat tuotteen tehokkuuteen Käytettävät menetelmät: Geeniekspressio profiilit, mikroarrayt, virtaussytometri, PCR jne. Eri tuotteille oma räätälöity potency assay

10 Potency Kaikkein vaikein kriteeri täyttää, koska monissa tapauksissa ei tiedetä mikä solun toiminassa aiheuttaa parantavan vaikutuksen Mitä pitäisi mitata? Ohjeistoja: Potency testing of cell-based immunotherapy medicinal products for the treatment of cancer Mahdollista osoittaa solutuotteen potency myös epäsuorasti/välillisesti Mitataan jotain muuta ominaisuutta joka suoraan korreloi solun haluttua toimintaa Täytyy pystyä osoittaan Esim. mitokondrion toiminnan mittaaminen joka korreloi suoraan mesejen erilaistumis- ja invaasioaktiivisuuksiin Merkittäviä toimintoja joita kantasoluilta vaaditaan

11 Potency Mahdollisia mitattavia ominaisuuksia:
Biologiselle toiminnalle relevanttien markkerien ekspression mittaaminen Pintamarkkerit CD200 immunosuppressiivisiin sovellutuksiin Erilaistumistehokkuus Testi täytyy olla validoitu ja kvantifioitu standardeja vastaan

12 Tumorigenicity Eroaa perinteisistä synteettisistä lääkkeistä, koska myös itse tuote voi transformoitua Mahdollinen solujen transformaatio täytyy pystyä arvioimaan mittaamalla: Proliferaatiota Apoptoosivastetta Genomista stabilisuutta/eheyttä

13 Solutuotteiden Karakterisointi

14 Solutuotteiden Karakterisointi
Prion Endogenous microbe Surgical infection Culture materials Equipm. Personnel Environm. Infection from donor Insufficient hygiene during cell transfer Contamination during cell manipulation Insufficient hygiene during cell harvest

15 Solutuotteiden Karakterisointi: Laatukriteerit

16 Solujen mitokondrion kunnon mittaaminen: laatumittari?
Olkiluodon Ydinvoimala

17 Mitokondrio Ulko – ja sisäkalvo Krista matriksi Solun voimalaitos
Toimintoja Energian tuotto Crebsin sykli hengitysketju Rasvahappojen hajoitus Solun sisäisen Ca2+ tason säätely Apoptoosin säätely Rakenne Ulko- ja sisäkalvo (kalvojen välinen tila) Matriksi (sisätila) Kristat Oma DNA ja proteiinisynteesikoneisto Ulko – ja sisäkalvo Krista matriksi

18 Mitokondrio Mitokondrion sisäkalvopotentiaali (DYm)
Hengitysketju sijaitsee sisäkalvolla Koostuu viidestä kompleksista 4+ F0F1 ATP syntaasi Elektronin siirtäjät (NADPH) kuljettavat elektronit hengitysketjuun Elektronit siirtyy kompleksista toiseen hapetuspelkistyreaktioiden kautta Protoneita pumpataan kalvojen välitilaan Syntyy gradientti (kalvopotentiaali) ATP-syntaasin kautta protonit siirtyy gradienttiä vastaan  energiaa ATP:n muodossa

19 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells Measurement of mitochondrial function Inner mitochondrial membrane potential (DYm) Published in Tissue Engineering Journal:Pietilä et al. Vol15:2009 Very sensitive for cellular stress Distinguishes four different cell populations with different viability Correlates with cellular function Validated with hMSCs Proliferation (MTT), Invasion efficiency, differentiation efficiency Rapid to execute, results within a same day (Compare to MTT which takes days to weeks) Flow cytometry based method allows a great amount of cells to analyse from one sample ( – cells)  reliable results Analysing of membrane organization and integrity AnnexinV: also early apoptosis indicator Propidium Iodide

20 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells R1 R2 R3 R4 R1: Viable, functional cells R2: Very early apoptotic, quiescence cells R3: Early apoptotic, late apoptotic R4: Late apoptotic, necrotic cells

21 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells

22 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells 0h 20 mM Menadione - known oxidative stress inducer 4h 6h

23 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells Mitokondrion kunnon mittaaminen ja osteogeeninen erilaistumistehokkuus

24 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells Mitokondrion kunnon mittaaminen ja Invaasiotehokkuus (MatriGel)

25 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells JC-1 Aggregates/JC-1 Monomers Excellent Cells 6 8 4 Good Cells 2 Average Quality Bad Cells Invasion efficiency 0-2,5 % ALP 1,0 U/mg prot Ca2+ 0,7 mM Invasion efficiency 2,5 % ALP 1,5 U/mg prot Ca2+ 1,9 mM Invasion efficiency 4,3 % ALP 2,4 U/mg prot Invasion efficiency 6,5 % ALP 2,6 U/mg prot Ca2+ 2,2 mM Cell therapy products for patients

26 Mitochondial function determines the viability and osteogenic potency of human mesenchymal stem cells Sovellutuksia: Tulevaisuuden soluterapiatuotteiden karakterisointiin Viability Potency? Tuotteiden tehokkuus ja turvallisuus Kliinisiin kokeisiin Taataan solutuotteiden toimivuus  tulokset vertailukelpoisia Lääketeollisuuteen in vitro toksikologisuustesteihin Kandidaatti lääkemolekyylien non-kliininen testaus Varhaisen vaiheen testaaminen