Kantasolut ja Soluterapia

Esitys aiheesta: "Kantasolut ja Soluterapia"— Esityksen transkriptio:

1 Kantasolut ja Soluterapia
Mika Pietilä Luentosarja TKK,

2 In vitro Soluviljely

3 In vitro Soluviljely

4 In vitro Soluviljely In vitro = Elimistön ulkopuolella, Koeputkessa, laboratoriossa kasvatetut solut/tehtävät kokeet In vivo = Elimistön sisällä tehtävät kokeet

5 Kudos/Soluviljely: Yleistä
1900-luvun alussa ensimmäiset kasvatukset Eläinten kudoksia Etuja verrattuna eläinmalleihin (in vivo): Tarkka ympäristön kontrollointi pH, O2, CO2 Näyte homogeeninen (yleensä) ja karakterisoitu Halvempaa ja automatisoitavissa Heikkouksia: Pieni solumäärä -> scale up Tyypillisessä elimessä noin 100 – 1500 miljardia solua In vitro tuotettavissa 10 miljoonasta – muutamaan miljardiin Vaikea mimikoida In vivo olosuhteita  erilainen solujen käyttäytyminen

6 Kudos/soluviljely: Yleistä
Primääriviljelmät = solut/elin/elimenosa joka eristetty suoraan eläimestä/ihmisestä Ensimmäisen jaon jälkeen (passage)  primäärisolulinja Kasvunopeus hidas, rajallinen kasvu Senescence (Hayflick limit) Fibroblastit, T-solut, kantasolut ym. kasvavat hyvin Sydänlihassolut pysyvät elossa muutamasta tunnista päivään

7 Kudos/soluviljely: Yleistä
Solulinja = jatkuvasti jakautuva solulinja, jonka elinikä on rajaton Peräisin kasvainkudoksesta Immortalisoidusta primäärisolulinjasta Säteilyn, kemiallisten mutageenien tai virusten avulla transformoitu HeLa solut Yleisesti käytetty solulinja ympäri maailmaa 1953 kloonattu solulinja, 31-v naisen kohdunkaulan syövästä

8 Soluviljelyn Perustarvikkeet
Kasvatusalustat Petrimaljat, T-pullot, kuoppalevyt etc. Alusta pinnoitetaan ECM molekyylillä Solujen tarttuminen Myös solujen toiminta Fibronektiini, Kollageeni, gelatiini ym. Feeder Solut (esim. hESC solujen sydänerilaistuminen, hiiren endoteelisolut) Medium Tarjoaa ravinteet ja muut tarvittavat tekijät soluille Seerumi (fetal calf, fetal bovine) Sisältää kasvutekijät, mieraalit, hormoonit ym. Sisältö ja pitoisuudet vaihtelee suuresti eri loteissa

9 Soluviljelyn Perustarvikkeet
Soluviljelyinkubaattori Lämpötila (+37oC) pCO2 (5%) pO2 (riippuu solutyypistä) Soluviljelylaminaari/tilat Mahdollistaa steriilin työskentelyn Tutkimustaso, GMP Muut tarvikkeet Valomikroskooppi, pipetit, suojapuku/hanskat, sterilointiaine (80 % EtOH) ym.

10 Soluviljelyn Perustarvikkeet
Kasvatusmediumin pääkomponentit: Komponentit Pitoisuus Merkitys Natriumkloridi 6-8 g/L Osmoottisen paine Epäorgaaniset suolat 0,8-1 g/L Tarjoaa veren kaltaisen elektrolyytti tasapainon Natriumbikarbonaatti 2-3 g/L pH tasapaino D-glukoosi 1 g/L Energian lähde Aminohappoja Typpilähde proteiini synteesiin Vitamiinejä 0,01 g/L Kofaktorit Fenolin punainen pH indikaattori Seerumi 1-20 % Katso alempi taulukko Lisätyt kasvutekijät 1-10 mg/L Solun kasvu ja toiminta Antibiootit 1-50 mg/L Estää mikrobikontaminaatiot

11 Soluviljelyn Perustarvikkeet
Seerumin pääkomponentit: Sisältö Vaikutus soluun Albumiini, globuliinit,transferriini Raudan, rasvahappojen ym. kantajat Fibronektiini, fetuiini Tarttumistekijöitä A2-makroglobuliini Proteaasi inhibiittori Kasvutekijät ja kasvuhormonit Edistää solujen jakautumista Hormoonit (insuulini, kortikosteroidit) Stimuloi sokerin ja aminohappojen sisäänottoa, muuttaa solujen kasvua Hiili- ja typpilähteet Ravinteita Mineraalit ja Trace elements? Edellytys metalloenzyymien toiminnalle Inhibiittorit Inhiboi solujen kasvua Yleensä välttämätön solujen kasvulle, mutta joissain tilanteissa haitallinen - Esim häiritsee joitain altistuskokeita (kasvutekijät, sytokiinit) - Voi sitoa/inhiboida lisättyjä tekijöitä

12 Solujen jako = Passage Viikoittainen rutiini
Solut jakautuessaan täyttävät kasvualustan Ei tilaa kasvulle Contact inhibition Siirrettävä uusille alustoille Kasvatetaan solumäärää

13 Solujen jako = Passage Confluency = kuinka tiiviissä solu ovat
Trypsiini (EDTA) Confluency = kuinka tiiviissä solu ovat 70 % confluency Yleisesti käytössä oleva raja Määritetään silmämääräisesti Kasvualustan pinta-alasta 70 % soluja Inaktivoidaan trypsiini mediumilla (seerumi) Lasketaan solut (Burkerin Kammio) Jako uusiin kasvatusalustoihin

14 Solujen jako = Passage Solut liian tiiviissä  solun toiminta voi muuttua PODXL ja CD49f tärkeitä hMSC toiminnassa Invaasio, migraatio, erilaistuminen Expressio solun pinnalla muuttuu solu-solu kontaktien yleistyessä Lee et al. 2009 70 % Confluency % Confluency Positive Positive Positive Positive