Ribosomit ja valkuaisainesynteesi

Esitys aiheesta: "Ribosomit ja valkuaisainesynteesi"— Esityksen transkriptio:

1 Ribosomit ja valkuaisainesynteesi
Chapter 6 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

2 DNA:sta proteiiniksi Geneettisen informaation kulku
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

3 Geenien tehokkuudessa eroja
Proteiini-määrissä selvä ero A:n hyväksi BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-3 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

4 RNA:n synteesi BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

5 Solut tuottavat useita RNA-tyyppejä
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Table 6-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

6 Transkription periaate
Eukaryoottien transkription alkaminen tarvitsee useita proteiineja Bakteereilla vain yksi RNA-polymeraasi Templaatti DNA:n lukusuunta 3’5’, polymeraasin suunta riippuu promoottorisekvenssin orientaatiosta, määrää paikan, mistä RNA-polymeraasi aloittaa transkription BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

7 Bakteerin RNA-polymeraasin transkriptiosykli
10 nukleotidin synteesin jälkeen RNA-polymeraasi menettää vuoro- vaikutuksen promootteri DNA:han BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

8 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Table 6-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

9 Eukaryootin geeni aloittaa transkription RNA-polymeraasi II:lla
Eukaryootin geeni aloittaa transkription RNA-polymeraasi II:lla. Promoottori sisältää DNA-skevenssin = TATA-box. TBP havaitsee sen ja sitoutuu.TFIIB tuodaan paikalle. Muut transkriptiotekijät ja RNA-polymeraasi tulevat paikalle. BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

10 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Table Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

11 mRNA:n kuljettaminen tumahuokosen läpi
vesikanava kypsyminen pakkaaminen BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-39a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

12 Ribosomit ja valkuaisainesynteesi
Mikrosomit ja ribosomien löytyminen Rakenne Proteiinisynteesin periaate Polyribosomit eli polysomit Translaatio ja proteiinien jatkokäsittely Virheiden minimointi Proteiinien hajoaminen BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

13 Mikrosomit ja ribosomien löytyminen
Palade & Siekevitz eristivät jaottelusentrifugaatiolla ns. mikrosomeja radioakt. aminohapot kertyivät mikrosomeihin, jotka peräisin rER:ää sisältävistä soluista  proteiinisynteesi soluliman basofiilinen aines RNA:ta (hav. 40-luvulla) EM: ø 30 nm:n jyväset vastasivat basofiilista materiaalia radioakt. aminohapot osoittivat jyväset valkuaisainesynteesin paikaksi BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

14 Ribosomit … RNA:sta mikrosomeille nimitys ribosomi
ribosomeja on kaikissa valk.ainesynteesiin pystyvissä soluissa prokaryooteilla hajallaan eukaryooteilla suuri osa liittynyt ER:n  rEr (spesifisesti proteiineja sitovat) BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

15 Rakenne mitokondrioissa ja viherhiukkasissa omat ribosomit
perusrakenne sama kaikissa soluissa 2 osaa (subunits), joissa molemmissa RNA:ta (2/3) ja proteiineja (1/3) BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

16 Ribosomit rakenne ... rakentuminen alayksiköistä itseohjautuva tapahtuma (perustuu rRNA:n informaatioon) ribosomipartikkelissa aina 2 uurretta: 1. syntyvää polypeptidiketjua varten 2. lähetti-RNA:ta varten nisäkässolussa n. 10x106 ribosomia ribosomaalinen RNA (rRNA) tuotetaan tumassa, sen tumajyväsessa (nukleolus) emäkset: A, G, C, U osa nukleotideista metyloituneita BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

17 Ribosomit rakenne … rRNA-geenit esiintyvät monistuneina, n. 200 kopiota/geeni  transkriptio tehokasta (huom! rRNA on lopputuote!) BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

18 bakteerit eukaryosyytit koko 21x29 nm, 70S MW 2,5 milj. 22x32 nm, 80S
alayksiköt 50S + 30S 60S + 40S suurempi alayksikkö 50S, MW 1,6 milj. 5S rRNA 0,12 kb 23S rRNA 2,9 kb 34 proteiinia 60S, MW 2,8 milj. 28S rRNA 4,7 kb n. 49 proteiinia pienempi alayksikkö 30S, MW 0,9 milj. 16S rRNA 1,54 kb 21 proteiinia 40S, MW 1,4 milj. 18S rRNA 1,9 kb n. 33 proteiinia (S = sedimentaatiovakio, koon, muodon ja tiheyden funktio, ei additiivinen esim. 30S + 50S = 70S, kb = kilobase = 1000 nukleotidia) BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

19 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

20 Proteiinisynteesin periaate 1
tapahtuu aina polyribosomeissa eli polysomeissa (lähetti-RNA:n eli mRNA:n toisiinsa liittämiä ribosomeja) tuma  mRNA mRNA:n 1 kodoni (3 emästä)  1 aminohappo prot. synteesissä ribosomi liukuu pitkin urassaan olevaa mRNA:ta mRNA määrää aminohappojärjes-tyksen eli proteiinin primaarirakenteen ribosomi käyttää 4 ATP:tä/peptidisidos BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

21 Proteiinisynteesin periaate 2
aminohapon tuo paikalle tRNA (siirtäjä eli transfer RNA) aminohappo + tRNA  aminoasyyli-tRNA (AA-tRNA), korkeaenerginen  tuottaa osan synteesin vaatimasta energiasta ah:n ja tRNA:n kytkee yhteen entsyymi, spesifinen tunnistus tRNA käsittää n. 80 nukleotidia  muod. polynukleotidiketju kiertyy 2-kierteeksi (komplementaariset emäkset) BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

22 Proteiinisynteesin periaate 3
poikkeavat emäkset  taipuminen ”apilanlehtikuvioon” aminohapon paikan tunnistaa tRNA eikä aminohappo itse mRNA:ta muokataan ennen proteiinisynteesiä mRNA:n synteesi = transkriptio mRNA:n viestin lukeminen (”kääntäminen”) = translaatio BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

23 tRNA tRNA modifioidaan kovalenttisesti ennen kuin poistuu tumasta
RNA-polymeraasi III syntetisoi eukaryoottien tRNA:t Aluksi isompi, joka trimmataan pienemmäksi Joissakin introneita, jotka poistetaan – leikka ja liimaa –systeemillä tRNA:n voi olla väärin laskostunut  splicing and trimming BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

24 tRNA Kaikki tRNA:t modifioidaan ensin, 1-10 nukleotidia muutetaan
Tunnetaan yli 50 tRNA:n modifikaatiota BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

25 tRNA:n syntetaasin editoiminen varmistaa laadun
Varmistetaan, että syntetaasi liittää oikean aminohapon tRNA:han Oikeaan ah:oon suurin affiniteetti Aminohapon liittäminen kovalenttisesti AMP:hen Hydrolyytin editoinnin avulla estetään virheet, 1/ tarkkuus Poistetaan virheellisesti kiinnittyneet aminohapot BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

26 Geneettinen koodi käännetään kahden adaptorin avulla
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

27 Hydrolyytin editointi
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

28 Translaatio kolme vaihetta: 1. Initiaatio eli aloitus
mRNA + 40S osa (pienempi osa) kolmen proteiinin (initiaatiofaktorit) avustamana energia GTP:stä solussa initiaatiokoodi aina AUG; koodaa aminohappo metioniinin bakteereissa, mitokondrioissa, kloroplasteissa; formylmetioniini kun met. kiinnittynyt paikoilleen  60S-osa kiinnittyy metioniinin jälkeen BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

29 Peptidiketju jatkuu 2 ah/s BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

30 Initiaatio 1 Suunta vasemmalta oikealle! Pienemmän alayksikön rooli?
Small ribosomal subunit Pienemmän alayksikön rooli? Upstream nucleotide sequence distinguishes initiation AUG sequence Initiator tRNA BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

31 Initiaatio 2 30S Initiation complex (mRNA aligned,
amino terminal Met in place) BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

32 Initiaatio 3 Mikä on suuremman yksikön rooli? Large ribosomal subunit
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

33 Initiaatio 4 70S initiation complex (ready for elongation)
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

34 Proteiinisynteesi ... 2. Elongaatio eli piteneminen
uusien ah:jen liittyminen n. 2 ah/s  keskikokoinen proteiini syntyy n. 60 sekunnissa ah:t liittyvät peptidiketjun karboksyylipäähän 3. Terminaatio eli lopetus lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA ribosomi hajoaa alayksiköikseen (dissosioituu)  prot. irtoaa  mRNA vapautuu irtoamiseen tarvitaan kaksi terminaatio-faktoria ja vielä yksi GTP BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

35 Elongaatio 1 A-puoli on oikealla ELONGATION Aminoacyl-tRNA P site
Peptidyl-tRNA A-puoli on oikealla BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

36 Elongaatio 2 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

37 Elongaatio 3 Peptide bond Uncharged-tRNA Peptidyl-tRNA
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

38 Elongaatio 4 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

39 Terminaatio Lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA Polypeptide TERMINATION
Peptidyl-tRNA mRNA Release factors Stop codon Lopetuskoodi: UAA, UAG, UGA BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

40 Link between polypeptide and tRNA broken Terminationn complex mRNA
Stop codon BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

41 Lopuksi ribosomi dissosioituu alayksiköikseen
Released polypeptide Lopuksi ribosomi dissosioituu alayksiköikseen BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Ribosomal subunits dissociate

42 Elongaatiofaktorit ohjaavat translaatiota ja lisäävät sen tarkkuutta
2 elongaatiofaktoria (EF) tuovat ribosomiin aminohapon ja jättävät ribosomin kunkin syklin aikana GTP hydrolysoituu  konformaatiomuutoksia prosessin aikana Bakteereilla: EF-Tu ja EF-G Eukaryooteilla: EF1 ja EF2 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

43 Translaatiosykli yksityiskohtaisesti
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

44 Vielä kerran proteiinisynteesin vaiheet yhdessä kuvassa
Completed polypeptide Growing polypeptide Start of mRNA (5´end) End of mRNA 3´end) Incoming ribosomal subunits BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

45 tRNA:n rakenne, bakteerin suurempi yksikkö (rtg-kristallografi)
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-69a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

46 23S rRNA kaavamainen rakenne. Emästen pariutuminen.
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-69b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

47 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

48 SRP receptor Mikä suuntaa polypeptidit ja sopivat signaalipeptidit esim. endoplasmakal-voston lumeniin? Docking proteiiniksi tai signaaliproteiiniksi sanottu reseptori (SRP) vetää polypeptidin lumeniin. Lumen of rough eendoplasmic reticulum Signal recognition particle (SRP) Signal peptidase Signal sequence (hydrophobic) Ribosome mRNA Protein synthesis inhibited Protein synthesis resumes Protein synthesis begins BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

49 Virheiden minimointi 1 mRNA kodoni ja tRNA:n antikodoni virhe 1/100
sidoksen löystyminen  virheet vähenevät 1/2000 mRNA:n kodonin lisäksi tRNA:n ”mutkalla” 3 sitoutumispaikkaa (A,R,P)  tRNA heilahtaa A  R, jos sidos mRNA:n ei riittävän luja, sidos irtoaa BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

50 Virheiden minimointi 2 vapaiden ribosomien syntetisoimat proteiinit suoraan solulimaan osittain sytosolin ribosomeissa, pääasiassa rER:n kalvoihin kiinnittyneissä ribosomeissa rER membraanin läpi ER:n onteloihin rER proteiineissa signaalisekvenssi alussa (leikataan myöhemmin pois) usein glykosylointi ER:n onteloissa Ks. edellinen luentokerta: Signaalijakso ohjaa ER sisällä, SRP, tyypin I ja II kalvoproteiinit, dolikolin merkitys glykoproteiinin synteesissä. BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

51 Laskostuminen voi alkaa synteesin aikana
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

52 Chaperonit auttavat laskostumisessa
Heat shock proteins HSP60 ja HSP70 (BIP) endoplasmakalvostossa BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

53 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

54 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

55 HSP70 chaperonina BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

56 Hydrofobiset alueet proteiinien laadun kontrolloimisessa
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

57 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

58 Proteiinien hajoaminen
Vain oikein laskostuneet proteiinit ja oikein muodostuneet proteiiniyhdistelmät pääsevät eteenpäin ER:ssa Virheellisesti laskostuneet hajoavat  endoplasmakalvostoon liittyvä proteiinien hajotus, ERAD (endoplasmic reticulum associated protein degradation) Ylijääneet alayksiköt hajotetaan samalla mekanismilla Hajotettavat proteiinit poistetaan ER:sta Hajotus sytoplasman proteasomeissa BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

59 Proteasomi BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

60 Proteiinien hajoaminen
Proteasomi on suuri useiden proteiinien muo-dostama entsyymiyhdistelmä, holoentsyymi. Ubikitiinin ja proteasomin osuus hajoamisessa BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

61 Proteiinin hajoaminen 1
Vaihe 1 Hajotettava proteiini kulkeutuu ulos endoplasmakal-vostosta sytoplasmaan BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

62 Proteiinin hajoaminen 2
Vaihe 2 Hajotettava proteiini merkitään useilla ubikitiineillä ja viedään proteasomille BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

63 Proteiinin hajoaminen 3
Vaihe 3 Ydinkappaleessa hajotettava proteiini pilkotaan peptideiksi Muut proteaasit ja aminopeptidaasit viimeistelevät hajotustyön Proteasomi koostuu säätelykappaleesta (19 S) ja ydinkappaleesta (20 S) 7-alayksikkö, 7, 7, 7. Proteolyyttiset kohdat  alayksiköissä. BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

64 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

65 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure 6-91b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

66 Ubikitiiniin liittyminen proteiineihin
Kolmivaiheinen entsyymijärjestelmä 1) E1-entsyymi aktivoi ubikitiinin, 2) E2 siirtää sen ubikitiiniligaasin-ryhmän entsyymille, 3) joka siirtää sen hajotettavaksi määrättyyn proteiiniin BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

67 Ubikitinaatio Ubikitinaatio on erittäin keskeinen osa solunsisäistä tiedonsiirtoa. solujen viestinvälityksessä solunjakautumisessa solukuolemassa BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

68 Ubikitiinin 3D-malli BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure 6-92a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

69 Ubikitiini merkkaa proteiinin
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-92b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

70 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure 6-92c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

71 BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010
Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

72 Epänormaalisti laskostuneet proteiinit monien sairauksien syynä
Sirppisoluanemia -1-antitrypsiini puutos  maksasairaus ja enfysema Mutantti proteiini pääsee läpi solujen laatukontrollista Kriittisten makromolekyylien aggregaatit tuhoavat soluja ja aiheuttavat solukuolemia Mutantti alleeli saattaa periytyä BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

73 Ihmisen sairauksiin liittyviä proteiiniaggregaatteja
Amyloidikasaumia Mikä sairaus? BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-95a,b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

74 Ristikkäisiä beta-filamentteja
Yleinen tyyppi proteaasi resistentistä proteiini aggregaatista Liittyy eräisiin ihmisen neurologisiin tauteihin BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-95c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

75 -helix muuttuu neljäksi suoraksi rakenteeksi (-strands)
Huntington, Alzheimer BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure 6-95d Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

76 Prionitauteja Leviävät organismista toiseen, yksilöstä toiseen
Scrapie lampailla Creutzfeldt-Jacob (CJD) ihmisellä Bovine spongiform encephalopathy (BSE) naudoilla Johtuu PrP-proteiinin epätäydellisestä laskostumisesta (PrP = prioniproteiini) PrP on normaalisti neuronien solukalvon ulkopinnalla BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010

77 Prioni-kannan luominen
Uusien alayksiköiden lisääminen amyloidityypit BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

78 Eukaryootin solun proteiinituotanto
BIOLOGIAN LAITOS, SEPPO SAARELA, 2010 Figure Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)